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融合蛋白
融合蛋白(fusion protein)有兩種不同的含義，一種是通過DNA重組技術(shù)得到的兩個基因重組后的表達(dá)產(chǎn)物。另一種含義就是介導(dǎo)兩個細(xì)胞質(zhì)膜融合的一組蛋白，如在仙臺病毒脂雙層外側(cè)小葉中含有的兩種糖蛋白之一，介導(dǎo)病毒被膜與宿主細(xì)胞質(zhì)膜的融合作用。另一種糖蛋白是血細(xì)胞凝集素神經(jīng)酰胺酶。兩個不同的蛋白質(zhì)連成一個大分子?？梢酝ㄟ^化學(xué)方法連接，也可以通過基因的融合來實現(xiàn)。
基本信息
| 中文名 | 融合蛋白 |
| 外文名 | fusion protein |
| 常見種類 | 免疫球蛋白（Ig）融合蛋白 |
| 連接方式 | 化學(xué)方法和基因融合 |
內(nèi)容簡介
融合蛋白圖片
融合蛋白-技術(shù)概況融合蛋白技術(shù)是為獲得大量標(biāo)準(zhǔn)融合蛋白而進(jìn)行的有目的性的基因融合和蛋白表達(dá)方法。利用融合蛋白技術(shù)，可構(gòu)建和表達(dá)具有多種功能的新型目的蛋白。
技術(shù)特點(diǎn)
技術(shù)內(nèi)容
基于重復(fù)結(jié)構(gòu)的融合蛋白大多為短肽，不具有復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)，因此只需簡單的多肽合成過程即可獲得目標(biāo)蛋白。由單個氨基酸合成多肽主要通過兩個氨基酸之間脫水形成肽鍵來實現(xiàn)，主要包括以下基本步驟:：首先對兩性離子結(jié)構(gòu)的氨基酸進(jìn)行相應(yīng)的氨基或羧基保護(hù)，其次將羧基活化為活性中間體，待耦合過程結(jié)束后，對肽鏈上氨基酸的保護(hù)基團(tuán)選擇相應(yīng)的方式進(jìn)行選擇性的脫除或者是全脫除。目前常用的多肽合成方法為液相合成和固相合成兩種。液相合成法是將所需的氨基酸配制成溶液，并對其中一個氨基酸的氨基、其余氨基酸的羧基和不參與反應(yīng)的側(cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行化學(xué)基團(tuán)保護(hù)，只活化參加反應(yīng)的氨基酸的羧基，待耦合反應(yīng)完成后再將沒有參加反應(yīng)的原料、活化劑等分離除去，得到純化多肽產(chǎn)物。這種方法雖然操作繁瑣，卻具有目標(biāo)產(chǎn)物純度高的優(yōu)勢。而固相合成法，則是將多肽序列C端的第1個氨基酸的羧基通過酯化反應(yīng)固定于不溶性的樹脂上，進(jìn)而以此氨基酸作為氨基組分，脫除其氨基保護(hù)基團(tuán)并同過量的活化后的羧基組分耦合形成肽鍵，重復(fù)脫保護(hù)、縮合、洗滌過程持續(xù)合成，獲得所需的肽鏈。合成完成后，再試用三氟乙酸將產(chǎn)物從樹脂上切割下來，同時脫除所有保護(hù)基團(tuán)，純化回收獲得所需多肽。
相對來說，具有一定空間結(jié)構(gòu)且序列復(fù)雜的其他兩種融合蛋白的合成過程則復(fù)雜得多。精確構(gòu)建所需DNA模版是保證融合蛋白多樣性及穩(wěn)定性的基礎(chǔ)。在獲得目標(biāo)DNA序列后，將其連接進(jìn)入特定的載體之中，以獲得充足融合蛋白質(zhì)粒。由于遺傳基因的簡并性，同一種融合蛋白可對應(yīng)著多種DNA序列，但序列合成蛋白效率卻與擴(kuò)增時選取的宿主種類有關(guān)(大腸桿菌、酵母菌及真核細(xì)胞等)。例如，“AAG及AGA”片段如果出現(xiàn)在需要使用大腸桿菌表達(dá)體系的質(zhì)粒中便會大大影響蛋白產(chǎn)率。重組質(zhì)粒中密碼子的優(yōu)化還有許多影響因素，密碼子偏倚、tRNA可用性、mRNA穩(wěn)定性和mRNA結(jié)構(gòu)都在基因表達(dá)中起重要作用，而且選擇DNA片段時也應(yīng)盡量避免在重組基因載體中存在高度重復(fù)的部分以避免發(fā)生錯配，影響mRNA轉(zhuǎn)錄。
1.進(jìn)行目的基因的克?。焊鶕?jù)基因序列互補(bǔ)原則，設(shè)計合適的引物序列，以cDNA為模板，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增不同的目的DNA片段。
2.在載體中進(jìn)行重組：通過限制內(nèi)切酶將兩個DNA片段進(jìn)行酶切并回收，然后通過連接酶將兩個具有相同末端酶切位點(diǎn)的基因片段進(jìn)行體外連接，并克隆到高表達(dá)質(zhì)粒載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒。
4.融合基因的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)蛋白的純化。
操作要點(diǎn)
在構(gòu)建融合蛋白中，一個關(guān)鍵的問題是兩蛋白間的接頭序列(Linker)，即連接肽。它的長度對蛋白質(zhì)的折疊和穩(wěn)定性非常重要。如果接頭序列太短，可能影響兩蛋白高級結(jié)構(gòu)的折疊，從而相互干擾；如果接頭序列太長，又涉及免疫原性的問題，因為接頭序列本身就是新的抗原。
一般來說，3-5個氨基酸的Linker可滿足大部分融合蛋白的正確折疊的要求。有人嘗試在融合蛋白間加入一段有疏水性和一定伸展性的較長肽鏈，如(Gly4Ser1)，目的是將兩者分開，以緩解相互干擾作用，并獲得了滿意的結(jié)果。但具體涉及到每種蛋白時，需具體分析。當(dāng)我們構(gòu)建融合蛋白時，應(yīng)多選擇幾種融合方式，從中優(yōu)化出理想的連接方式。另外，大量研究表明連接肽的柔性和疏水性對不擾亂蛋白質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)域是十分重要的。
遺憾的是，目前對于連接肽序列的設(shè)計還沒有可靠的選擇標(biāo)準(zhǔn)。現(xiàn)在，大多數(shù)連接肽序列的設(shè)計和選擇仍主要依賴于直覺。盡管依賴于蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)來預(yù)測其二級結(jié)構(gòu)已經(jīng)產(chǎn)生了重大的進(jìn)步，但是我們對于序列和結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系的了解還是很有限的。
結(jié)構(gòu)設(shè)計
構(gòu)建融合蛋白的基本方法是將具有特定功能的天然或人工編碼的多肽序列模塊化，并使用基因編碼的DNA序列模板合成，隨后將第1個蛋白的終止密碼子刪除，再接上帶有終止密碼子的第2個蛋白基因，以實現(xiàn)兩個基因的共同表達(dá)。通過控制每一個功能肽模塊在整體蛋白材料中的確切位置和密度，人們便能夠根據(jù)實際需要改變?nèi)诤系鞍椎慕M成。
融合蛋白的設(shè)計大致分為基于重復(fù)結(jié)構(gòu)、基于生長因子以及基于細(xì)胞粘附分子3類。第1類融合蛋白中最典型的是來源于彈性蛋白(Elastin-Like Polymers，ELPs)及絲素蛋白(Silk-Like Polymers，SLPs) 的融合蛋白。ELPs是一種由數(shù)個重復(fù)的氨基酸序列組成的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，由兩種短肽段交替排列構(gòu)成，主要包括VPGZG、VPGVG、APGVGV、VPGFGCGAG以及VPGG等5種。最著名的當(dāng)屬VPGZG融合蛋白(Z可換為除了脯氨酸外任意氨基酸)。重復(fù)的VPGVG序列能夠使融合蛋白具有溫敏特性，將溫敏性ELP與化學(xué)、酶、物理等多種交聯(lián)方式的水凝膠結(jié)合起來能夠衍生出多種應(yīng)用方式。ELPs主要由甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸組成，極易形成反向平行的β－折疊片層結(jié)構(gòu)，具有多樣側(cè)鏈化學(xué)修飾位點(diǎn)，良好的熱穩(wěn)定性和機(jī)械性能，在生物醫(yī)學(xué)上常用作手術(shù)縫合線，人工皮膚及軟骨修復(fù)材料。對于此類融合蛋白，只需通過調(diào)節(jié)其氨基酸序列和分子鏈長度，便能夠精確控制其對溫度、pH、離子強(qiáng)度的響應(yīng)敏感性，從而實現(xiàn)可逆的溶解轉(zhuǎn)變。
臨床應(yīng)用
1、DNA疫苗
目前，疫苗已經(jīng)經(jīng)歷了三代：第一代疫苗是用減毒或殺死的病原體來激活機(jī)體免疫系統(tǒng)；第二代疫苗是用生物技術(shù)和重組DNA技術(shù)研制的組分疫苗注射機(jī)體誘導(dǎo)免疫應(yīng)答；第三代疫苗是直接注射基因重組的抗原基因來激活人體免疫系統(tǒng)，即DNA疫苗。
DNA疫苗與傳統(tǒng)疫苗相比有著明顯的優(yōu)勢，如易于生產(chǎn)，穩(wěn)定性強(qiáng)，成本低廉等，并可同時誘導(dǎo)體液與細(xì)胞免疫應(yīng)答。
目前利用基因工程成功制成的多價重組抗體融合蛋白CYF196(國內(nèi)尚未上市)就是一種DNA疫苗，它能有效防治下呼吸道感染和哮喘。因為CYF196對病毒的主要受體-位于呼吸道上皮中的細(xì)胞間黏附分子有高度親和力，對鼻病毒感染有較強(qiáng)的防御功能。
2、雙功能酶（多功能酶）
以往研究發(fā)現(xiàn)，在利用基因融合所構(gòu)建的大的酶分子中，如果用以構(gòu)成融合蛋白的各個酶分子的整個編碼序列均保留于新的酶分子中，則融合蛋白一般均保留所構(gòu)成的酶分子各自的酶活性。
并且發(fā)現(xiàn)在這些新構(gòu)建的融合蛋白中，蛋白的正確折疊以及各個酶的活性部位均未受到影響，與單個酶相比，融合蛋白的酶的比活力為50%-100%，對于催化連續(xù)反應(yīng)的兩種或幾種酶，利用基因融合的方法構(gòu)成的融合蛋白可產(chǎn)生“鄰近效應(yīng)”（proximity effect）。
目前研究發(fā)現(xiàn)，β-半乳糖苷酶-半乳糖脫氫酶融合蛋白在一定條件下，其偶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生NADH的速度是同時加入這兩種酶的反應(yīng)速度的兩倍以上。同時過渡態(tài)時間縮短近四倍。
3、定向藥物
定向藥物一般由兩部分組成：一部分是藥物；另一部分是可以與病灶特異性結(jié)合的配基。通過融合蛋白技術(shù)將這兩部分融合在一起，即可構(gòu)成一個具有獨(dú)特構(gòu)象與功能的蛋白質(zhì)。
4、基因表達(dá)
基因融合技術(shù)最早即是被用來在細(xì)菌（主要是大腸桿菌）中表達(dá)外源蛋白，如somatostatin4、insulin5等，對于外源基因（尤其是真核基因），利用融合表達(dá)的方法在大腸桿菌中表達(dá)有很多優(yōu)點(diǎn)，一是由于外源基因一般是被連接到可供融合的蛋白的C端編碼序列之后，因此不需另外設(shè)計SD序列，同時，N端融合基因的存在，使得外源基因的表達(dá)相對比較容易。其二是外源基因的表達(dá)產(chǎn)物常常會被宿主細(xì)胞的蛋白酶所降解，當(dāng)外源基因與宿主本身的某種蛋白如β-半乳糖苷酶的部分編碼序列構(gòu)成融合基因，以融合蛋白的形式表達(dá)時，往往會減低宿主細(xì)胞對產(chǎn)物的降解。
常見的幾種
免疫球蛋白（Ig）融合蛋白
免疫球蛋白融合蛋白是指在基因水平將目的基因同Ig部分片段基因相連，并在真核或原核細(xì)胞中表達(dá)出的具有上述兩部分結(jié)構(gòu)域的重組蛋白。據(jù)目的蛋白與Ig不同片段相連，可將其分為二大類：一類為Fab(Fv)融合蛋白；另一類為Fc融合蛋白。
甲狀旁腺激素（PTH）融合蛋白
甲狀旁腺激素(Parathyroid Hormone，PTH)是由甲狀旁腺主細(xì)胞合成和分泌的一種單鏈多肽激素，成熟PTH含84個氨基酸殘基，分子量約為9500，是人體內(nèi)調(diào)節(jié)鈣磷代謝及骨轉(zhuǎn)換的最為重要的激素之一。它主要通過作用于靶細(xì)胞膜上腺苷酸環(huán)化酶系統(tǒng)，增加胞漿內(nèi)cAMP及焦磷酸鹽(PPi)的水平來發(fā)揮作用。
細(xì)胞因子重組融合蛋白
細(xì)胞因子重組融合蛋白是一類利用基因工程的方法將編碼細(xì)胞因子和其他有特定功能的蛋白分子基因序列連接并表達(dá)相應(yīng)蛋白質(zhì)融合產(chǎn)物。其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為將細(xì)胞因子功能活性域與其他分子的活性域融合，各組分可發(fā)揮協(xié)同作用，使融合蛋白的生物學(xué)活性較各單體大大增強(qiáng)。
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