1. 真核細(xì)胞表達(dá)外源蛋白質(zhì)的缺點(diǎn)
一些蛋白質(zhì)需要翻譯后的修飾,如糖基化,則必須選用真核細(xì)胞。但是無論是正在臨床的還是市場上的蛋白質(zhì)藥物,主要的是以大腸桿菌作為宿主細(xì)胞。 包涵體
1982年第一次選用大腸桿菌作為表達(dá)重組DNA的宿主細(xì)胞,表達(dá)的產(chǎn)物是人胰島素。選擇原核細(xì)胞作為表達(dá)載體,因?yàn)檎婧思?xì)胞表達(dá)外源蛋白質(zhì)有其缺點(diǎn):(1)真核細(xì)胞的天然蛋白質(zhì)的表達(dá)和外源蛋白質(zhì)的表達(dá),表達(dá)量相當(dāng)少,即使有的蛋白質(zhì)表達(dá)量高時(shí),容易出現(xiàn)蛋白質(zhì)的無活性的現(xiàn)象,或者形成聚集體;而原核細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)量比真核細(xì)胞大很多;
(2)相對于大腸桿菌,人類對于真核細(xì)胞的基因的了解還是有限的,而對大腸桿菌的基因了解的相當(dāng)透徹,并能進(jìn)行熟練的基因重組等操作對大腸桿菌的基因進(jìn)行改造;
(3)真核細(xì)胞生長到高密度需要更長的時(shí)間(7天左右),并且細(xì)胞的最終濃度低,所以需要較大的培養(yǎng)容器,而大腸桿菌可以在幾個(gè)h以內(nèi)達(dá)到108cells/mL; (4)動(dòng)物細(xì)胞生長的培養(yǎng)液的造價(jià)較高,并且大部分使用血清作為生長液的添加劑,從而提高了產(chǎn)品的造價(jià)并且不利于以后的純化步驟;
包涵體
(5)原核細(xì)胞的堅(jiān)硬的細(xì)胞壁,可以使用簡單的攪拌的方法完成傳熱、傳質(zhì)過程,而大部分的真核細(xì)胞需要溫和的培養(yǎng)方法及復(fù)雜的操作以達(dá)到其對培養(yǎng)基的要求。基于以上的原因,真核細(xì)胞尤其是哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)外源蛋白質(zhì)大部分處在研究階段,大部分重組蛋白質(zhì)使用的表達(dá)載體是大腸桿菌細(xì)胞。大腸桿菌表達(dá)的外源蛋白質(zhì)量相當(dāng)大,有時(shí)達(dá)到細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)總量的5-20%,甚至達(dá)到50%以上。但是,大腸桿菌表達(dá)的蛋白質(zhì),當(dāng)含量相當(dāng)大時(shí),有時(shí)由于原核細(xì)胞缺少分泌到胞外的機(jī)制或者折疊的機(jī)制,最后表達(dá)的蛋白質(zhì)往往以無活性的包涵體的形式存在。
2. 包涵體表達(dá)蛋白質(zhì)的優(yōu)越性
為了研究基因的功能,可以把體內(nèi)的基因轉(zhuǎn)移到其他表達(dá)宿主中,研究基因表達(dá)性狀以確定基因的功能。但是,外源基因的表達(dá),特別是真核生物基因在大腸桿菌中的表達(dá),由于宿主菌缺乏此種基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制,細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)環(huán)境與其天然環(huán)境差異,如氧化還原環(huán)境、胞內(nèi)pH、自由水的濃度,以及外源基因的導(dǎo)入,使得表達(dá)目的蛋白質(zhì)的細(xì)胞在非正常狀態(tài)下生長,表達(dá)的蛋白質(zhì)多數(shù)以無活性的包涵體的形式存在。 在下游生產(chǎn)過程中特別是在醫(yī)藥生產(chǎn)中,以包涵體形式表達(dá)的蛋白質(zhì)具有一些優(yōu)越性。
(1)異源表達(dá)的蛋白質(zhì)很容易被宿主細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)酶降解,如果重組蛋白質(zhì)以包涵體形式表達(dá),由于包埋了酶攻擊的位點(diǎn),可以最大限度地抵抗蛋白質(zhì)酶的攻擊;
(2)包涵體表達(dá)的蛋白質(zhì)沒有活性,細(xì)胞破碎和以后的純化步驟不用考慮蛋白質(zhì)的失活問題;
(3)包涵體形式表達(dá)的蛋白質(zhì)與宿主細(xì)胞的其他蛋白質(zhì)的分離比可溶蛋白質(zhì)的分離方法簡便,造價(jià)低,使用簡單的離心或者過濾的手段就能使包涵體與宿主細(xì)胞的其他蛋白質(zhì)成分進(jìn)行有效的分離;
(4)有些表達(dá)的外源蛋白質(zhì)對細(xì)胞有毒性或者致死,大量表達(dá)時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的死亡,最終的細(xì)胞數(shù)量和產(chǎn)物相當(dāng)?shù)停欢w形式的蛋白質(zhì)由于喪失了生物活性從而可以高效大量地表達(dá);
(5)對于以包涵體形式表達(dá)的產(chǎn)物可以比較容易進(jìn)行在線觀測定性,含有包涵體蛋白質(zhì)的細(xì)胞有較大的折射率,不必像可溶的蛋白質(zhì)需要細(xì)胞破碎后使用酶學(xué)或者電泳學(xué)的方法進(jìn)行鑒定。
包涵體
包涵體的形成和蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)或者高鹽情況下的沉淀是不同的。在沉淀過程中,分子是通過分子表面的相互作用而形成的分子的聚集,無論在聚集的沉淀狀態(tài)還是在天然狀態(tài),沒有明顯的構(gòu)象的變化。因此,當(dāng)溶液中的pH重新改變,或者沉淀重新溶解的時(shí)候,蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和活性會(huì)重新獲得。蛋白質(zhì)的包涵體形式的聚集則不同于蛋白質(zhì)的沉淀,把包涵體蛋白質(zhì)直接溶解在天然的緩沖液中得不到天然的構(gòu)象,無活性的聚集體與其天然活性形式之間沒有自然的平衡轉(zhuǎn)化的過程。包涵體的形成是由于范氏引力、疏水作用力和二硫鍵等作用力形成的,破壞這些作用力比較困難,溶解包涵體需要加入強(qiáng)的變性劑破壞多肽鏈之間的作用力,說明聚集體的多肽鏈之間的作用力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于普通的沉淀的分子間的作用力。當(dāng)變性劑溶解的包涵體只是簡單地通過稀釋或者透析除去變性劑,而不是尋找合適的復(fù)性的條件的話,聚集體會(huì)重新形成,并且,不同于沉淀溶解的100%的活性的保留,包涵體的復(fù)性水平往往很低。所以,蛋白質(zhì)沉淀是活性的天然蛋白質(zhì)之間的作用力形成的,而包涵體的形成是在細(xì)胞內(nèi)新合成的蛋白質(zhì)肽鏈中間體而形成的,體外折疊時(shí)的聚集體是折疊過程中折疊中間體形成的。這些折疊的中間體并不一定是形成高級天然結(jié)構(gòu)的中間體,從天然結(jié)構(gòu)也不能推論出折疊中間體的構(gòu)象。