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原位雜交
本詞條是多義詞，共3個義項
用于基因定位的技術(shù)
原位雜交是指將特定標(biāo)記的已知順序核酸為探針與細(xì)胞或組織切片中核酸進行雜交，從而對特定核酸順序進行精確定量定位的過程。原位雜交可以在細(xì)胞標(biāo)本或組織標(biāo)本上進行。有熒光原位雜交。
基本信息
| 中文名 | 原位雜交 |
| 外文名 | in situ hybridization |
| 運用領(lǐng)域 | 生物學(xué) |
| 影響 | |
| 應(yīng)用 | 基因定位、病毒檢測等 |
概述
將標(biāo)記的核酸探針與細(xì)胞或組織中的核酸進行雜交，稱為原位雜交！使用DNA或者RNA探針來檢測與其互補的另一條鏈在細(xì)菌或其他真核細(xì)胞中的位置。
RNA原位核酸雜交又稱RNA原位雜交組織化學(xué)或RNA原位雜交。該技術(shù)是指運用cRNA或寡核苷酸等探針檢測細(xì)胞和組織內(nèi)RNA表達的一種原位雜交技術(shù)。其基本原理是：在細(xì)胞或組織結(jié)構(gòu)保持不變的條件下，用標(biāo)記的已知的RNA核苷酸片段，按核酸雜交中堿基配對原則，與待測細(xì)胞或組織中相應(yīng)的基因片段相結(jié)合(雜交)，所形成的雜交體(Hybrids)經(jīng)顯色反應(yīng)后在光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡下觀察其細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的mRNA、rRNA和tRNA分子。RNA原位雜交技術(shù)經(jīng)不斷改進，其應(yīng)用的領(lǐng)域已遠超出DNA原位雜交技術(shù)。尤其在基因分析和診斷方面能作定性、定位和定量分析，已成為最有效的分子病理學(xué)技術(shù)，同時在分析低豐度和罕見的mRNA表達方面已展示了分子生物學(xué)的一重要方向。
原位雜交
原理
原位雜交技術(shù)的基本原理是利用核酸分子單鏈之間有互補的堿基序列，將有放射性或非放射性的外源核酸(即探針)與組織、細(xì)胞或染色體上待測DNA或RNA互補配對，結(jié)合成專一的核酸雜交分子，經(jīng)一定的檢測手段將待測核酸在組織、細(xì)胞或染色體上的位置顯示出來。為顯示特定的核酸序列必須具備3個重要條件：組織、細(xì)胞或染色體的固定、具有能與特定片段互補的核苷酸序列(即探針)、有與探針結(jié)合的標(biāo)記物(曾呈奎等2000)。
組織診斷在許多生命中扮演著至關(guān)重要的作用，專注于質(zhì)量、速度和效率將會產(chǎn)生很大的變化。原位雜交離不開染色，高級染色的各個方面，以及量身定制解決方案所需的選件，都整合到IHC和ISH染色之中。
實驗步驟
質(zhì)粒制備
1質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和擴增
1．取400uLXL1-Blue菌種加入到含200mlLB培養(yǎng)基的錐形瓶中，37℃、100rpm培養(yǎng)4h，離心，倒置，以冰冷的0.1mol／LCaCl_2重懸細(xì)菌，冰浴30min，離心，棄上清，倒置，再加4ml(含15％甘油)冰冷的CaCl2重懸細(xì)菌，分裝(200μ／tube)，-80℃保存。
2．轉(zhuǎn)化：在冰浴中將1管XL1-Blue感受態(tài)菌解凍，將濃度為2ng／μ1的質(zhì)粒DNA4μ1加入到8Oμ1感受態(tài)菌中。
3．輕輕搖勻，冰浴30min。
4．42℃熱激9O秒，然后迅速冰浴2min。
5．加入LB培養(yǎng)液(無氨芐青霉素)0.8ml，在37℃，100轉(zhuǎn)／min水浴孵育60min。
6．取200μl菌液鋪于瓊脂板上(涂有X-Gal(20mg／ml)-IPTG(200mg／ml)的LB-氨芐青霉素50mg／ml,1μl／ml培養(yǎng)基)，待菌液全部被吸收后，倒置平板于37℃培養(yǎng)12-16h。
1．用無菌牙簽挑取單菌落，接種到10ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液的離心管中，于37℃，200轉(zhuǎn)／分培養(yǎng)2h，取1ml之一EPPENDORF離心管，加50μl10mmol／LEDTA(pH8.0)。
3．在70℃溫育5min，然后冷卻到室溫。
4．加1.5μ14mol／LKCl和0.5μ1含0.4％溴酚蘭染液，振蕩3O秒后，冰浴5min。
5．12000g，4℃離以3min，以除去細(xì)菌碎片。
1.3質(zhì)粒的擴增和純化
1．用無菌牙簽分別挑取單個白色菌落移入含30mlLB-氨芐青霉素(50μg／ml)培養(yǎng)液的聚丙烯管中，于37℃，200轉(zhuǎn)／分培養(yǎng)3h。
2．將菌液轉(zhuǎn)入含70mlLB-氨芐青霉素培養(yǎng)液的250ml錐形瓶中，37℃，200轉(zhuǎn)／分培養(yǎng)過夜(12-16h)，細(xì)菌渾濁。
4.將培養(yǎng)的細(xì)菌倒入50ml的離心管中，6000rpm，4℃離,th,15min，沉淀細(xì)菌。
5.棄凈上清夜，用2ml預(yù)冷的溶液I，懸浮菌體沉淀，劇烈振蕩，于室溫靜置5min
6.加入新配制的溶液II4ml，快速用手晃動10秒，顛倒數(shù)次后，于室溫靜置10min。
7.加入預(yù)冷的溶液III3ml，溫和振蕩l0秒，于冰上靜置10min，出現(xiàn)白色絮狀沉淀。
8．6000rpm，4℃離心15min，保留上清。
10.12000rpm，4℃離心15min，回收核酸。小心棄去上清，倒置離心管使殘兼上清液流盡。
11．于室溫用70％的乙醇洗滌沉淀物和管壁，室溫12000rpm離心，15min，充分棄去乙醇，于室溫將離心管倒置在紙巾上，使最后殘余的痕量乙醇揮發(fā)殆盡。
12．用500μlTE(pH8.0)溶解核酸沉淀，轉(zhuǎn)移至1.5mlEppendorf管中。
13．加入用冰預(yù)冷的5mol／L的LiCl溶液600μl，充分混勻。12000rpm，4℃離心15min，以沉淀高分子量的RNA。
14.將上清轉(zhuǎn)移到另一1.5mlEppendorf管中，加等量異丙醇，充分混勻，于室溫靜置10min。
15.12000rpm,4℃離心15min，回收核酸。小心棄去上清，倒置離心管使殘余上清液流盡。
16．于室溫用70％的乙醇洗滌沉淀物和管壁，室溫12000rpm離心，15min，充分棄去乙醇，于室溫將離心管倒置在紙巾上，使最后殘余的痕量乙醇揮發(fā)殆盡。
17.400μl含無DNA酶的RNA酶(20μg/ml)的TE緩沖液(pH8.0)溶解沉淀，將溶液轉(zhuǎn)移到另－1.5mlEppendorf管中，室溫放置1.5mlEppendorf管中30min。
21．于4℃12000rpm離心5min回收沉淀的質(zhì)粒DNA。盡可能棄去上清，敞開管口，置工作臺上使殘留的痕量乙醇蒸發(fā)殆盡。
22．加入400μl處于4℃的70％乙醇，稍加振蕩，漂洗沉淀，4℃12000rpm離心2min。
23．吸去上清，室溫敞開管口，直到乙醇完全揮發(fā)。
24．用100μlTE緩沖液(pH8.0)溶解沉淀。
25．取4μl溶液1：100稀釋后，測定其OD260、OD280，以確定質(zhì)粒DNA的純度和濃度(OD260／OD280>1.8。OD260／OD280對DNA而言其值大約為
26．質(zhì)粒DNA溶液于-20℃保存待用。
探針標(biāo)記
3．進行體外轉(zhuǎn)錄，步驟如下：
質(zhì)粒DNA模板0.05μg／μl1μl
10xNTP地高辛標(biāo)記混合物1x2μl
0.1MDTT溶液10mM2μl
RNAse抑制劑2U／μl1μl
RNA聚合酶2U/μl2μl
反應(yīng)體系總體積20μl
5．加入上述各試劑后，混勻，簡短離心后在37℃孵育2h。
6．加入2μl無RNA酶的DNA酶I(10U／μ1)，37℃孵育15min降解模板DNA。
8．加入2.5μl的4MLicl和7.5μl冷的無水乙醇，混勻，-20℃放置2h。
9．12000g下離以15min，棄上清，小心地用50μl冷的70％乙醇洗滌沉淀。
10．室溫下稍干燥，溶于100μ1DEPC處理過的三蒸水中，混勻分裝，-20℃下保持備用。
步驟
3.1冰凍切片與雜交前預(yù)處理
1．將子宮樣品從-80℃取出，用OCT包埋，在-23℃(切片機腔體溫度)平衡至少30min。將包埋好的樣品固定在樣品頭上，切10μm厚的連續(xù)組織切片，平鋪于涂有多聚賴氨酸(1mg／m1)的玻片上(玻片預(yù)先經(jīng)180℃干烤6小時)，保存于-70℃冰柜備用。
2．冰凍切片經(jīng)室溫干燥10min后，在4％的多聚甲醛-PBS(pH7.4)固定l0min。
5．在切片上滴加蛋白酶K(0.1μg／m1)，37℃孵育15min，重復(fù)步驟4)。
6．經(jīng)0.1MTEA(三乙醇胺)作用5min后，再在新配制的0.25％AA／0.1MTEA(乙酸酐／三乙醇胺，pH8.0)中乙酰化10min。(在大多數(shù)實驗中，步驟4，5，6省略)
7．5xSSC中平衡15min。
3.2雜交
8．在脫水后的玻片上滴加預(yù)雜交液(約100μl／玻片)，置于放有濕盒液(50％甲酰胺v／v；0.3MNaCl；1MmEDTA；10mMTris-Cl，pH8.O)的濕盒中，55～58℃下的烘箱中預(yù)雜交2h。
9．甩掉預(yù)雜交液，地高辛標(biāo)記的反義或正義cRNA探針(濃度1-2ng／μl)經(jīng)70℃變性1O分鐘，置冰上1min，玻片上滴加預(yù)雜交液(約60μl／玻片)，覆蓋parafilm膜，放濕盒中在48～58℃下雜交18-30h。
3.3雜交后處理
10．取出玻片，小心去掉Parafilm膜，甩掉雜交液，用52℃預(yù)熱的5×SSC洗30min。
11．在無DNA的RNA酶A(20μg／ml)溶液中37℃下孵育30min。
12．分別依次用52℃預(yù)熱的2XSSC，1XSSC和O.1XSSC洗2次，每次30min。
3.4雜交信號檢測
13．在緩沖液A(0.1MTris-HC1pH7.5，0.15MNaC1)中平衡5min。
14．在玻片上滴加堿性磷酸酶的抗地高辛抗體(1：500～1:2000稀釋于含0.5％阻斷液的緩沖液A中)，室溫反應(yīng)2h。
15．用緩沖液A洗2次，每次15min。
18．充分顯色后，用EDTA(1mMEDTA，pH8.0)洗15min終止反應(yīng)。
19．在95％乙醇中洗lh以除去非特異的背景。
20．用蒸餾水洗15min除去可能存在的結(jié)晶體。
22．充分干燥后在顯微鏡下觀察、照相。
前固定
原位雜交組織化學(xué)技術(shù)（InSituHybridizationHistochemistry,ISHH）在固定劑的應(yīng)用和選擇上應(yīng)兼顧到三個方面：保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)，最大限度地保持細(xì)胞內(nèi)DNA或RNA的水平；使探針易于進入細(xì)胞或組織。DNA是比較穩(wěn)定的，mRNA是相對穩(wěn)定的但易為酶合成和降解。RNA卻絕然不同，非常容易被降解。因此，對于DNA的定位來說，固定劑的種類和濃度并不十分重要。相反，在RNA的定位上，如果要使RNA的降解減少到最低限度，那么，不僅固定劑的種類濃度和固定的時間十分重要，而且取材后應(yīng)盡快予以冷凍或固定。在解釋ISHH的結(jié)果時應(yīng)考慮到取材至進入固定劑或冰凍這段時間對RNA保存所帶來的影響，因組織中mRNA的降解是很快的。在固定劑中，最常用的是多聚甲醛。和其它的固定劑（如戊二醛）不同，多聚甲醛不會與蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛的交叉連接，因而不會影響探針穿透入細(xì)胞或組織。
其它如醋酸-酒精的混合液和Bouin’s固定劑也能獲得較滿意的效果。對于mRNA的定位，我們常采用的方法是將組織固定于4%多聚甲醛磷酸緩沖液中1～2h，在冷凍前浸入15%蔗糖溶液中，置4℃冰箱過夜，次日切片或保存在液氮中待恒冷箱切片機或振蕩切片機切片。組織也可在取材后直接置入液氮冷凍，切片后才將其浸入4%多聚甲醛約10min，空氣干燥后保存在-70℃。如冰箱溫度恒定，在-70℃可保存數(shù)月之久不會影響雜交結(jié)果。在病理學(xué)活檢取材多用福爾馬林固定和石蠟包埋，這種標(biāo)本對檢測DNA和mRNA有時也可獲得雜交信號，但石蠟包埋切片由于與蛋白質(zhì)交叉連接的增加，影響核酸探針的穿透，因而雜交信號常低于冰凍切片。同時，在包埋的過程中可減低mRNA的含量。
其它固定劑如應(yīng)用多聚甲醛蒸汽固定干燥后的冷凍切片也可獲得滿意效果。各種固定劑均有各自優(yōu)缺點，如沉淀性（Precipitating）固定劑：酒精/醋酸混合液、Bouin’s液、Carnoy’s液等能為增加核酸探針的穿透性提供最佳條件，但它們不能最大限度地保存RNA，而且對組織結(jié)構(gòu)有損傷。戊二醛能較好地保存RNA和組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，但由于和蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛的交叉連接，從而大大地影響了核酸探針的穿透性。至今，多聚甲醛仍被公認(rèn)為ISHH較為理想的固定劑。
處理
1．玻片的處理。玻片包括蓋片和載片應(yīng)用熱肥皂刷洗，自來水清洗干凈后，置于清潔液中浸泡24h，清水洗凈烘干，95%酒精中浸泡24h后蒸餾水沖洗、烘干，烘箱溫度最好在150℃或以上過夜以去除任何RNA酶。蓋玻片在有條件時最好用硅化處理，錫箔紙包裹無塵存放。由于ISHH的實驗周期長，實驗程序繁雜，因此，要應(yīng)用粘附劑預(yù)先涂抹在玻片上，干燥后待切片時應(yīng)用，以保證在整個實驗過程中切片不致脫落。常用的粘附劑有鉻礬-明膠液，其優(yōu)點是價廉易得，但在長周期實驗過程中，粘附效果不夠理想。多聚賴氨酸液具有較好的粘附效果，但價格昂貴，需進口。
2．增強組織的通透性和核酸探針的穿透性。此步驟根據(jù)應(yīng)用固定劑的種類、組織的種類、切片的厚度和核酸探針的長度而定。比如用戊二醛固定的組織由于其與蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛的交叉連接就需要應(yīng)用較強的增強組織通透性的試劑。增強組織通透性常用的方法如應(yīng)用稀釋的酸洗滌、去垢劑（detergent）或稱清洗劑TritonX-100、酒精或某些消化酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶、膠原蛋白酶和淀粉酶（diastase）等。這種廣泛的去蛋白作用無疑可增強組織的通透性和核酸探針的穿透性，提高雜交信號，但同時也會減低RNA的保存最和影響組織結(jié)構(gòu)的形態(tài)，因此，在用量及孵育時間上應(yīng)慎為掌握。
蛋白酶K（ProteinaseK）的消化作用在ISHH中是應(yīng)用于蛋白消化的關(guān)鍵步驟，其濃度及孵育時間視組織種類、應(yīng)用固定劑種類、切片的厚薄而定。一般應(yīng)用酶K1μg/ml(于0.1mol/LTris/50mmol/LEDTA,pH8.0緩沖液中),37℃孵育15～20min，以達到充分的蛋白消化作用而不致影響組織的形態(tài)為目的。蛋白酶K還具有消化包圍著靶DNA的蛋白質(zhì)的作用，從而提高雜交信號。在蛋白酶K消化后，應(yīng)用0.1mol/L的甘氨酸溶液（在PBS中）清洗以終止蛋白酶K的消化作用，甘氨酸是蛋白酶K的抑制劑。為保持組織結(jié)構(gòu)，通常用4%多聚甲醛再固定。Burns等（1987）報告應(yīng)用胃蛋白酶（pepsin）20～100μg/ml（用0.1NHCl配）37℃、30min進行消化，所獲實驗結(jié)果優(yōu)于蛋白酶K。
不少實驗工作者在多聚甲醛固定后，浸入乙酸酐（aceticanhydride）和三乙醇胺（tri－ethanolamine）中以減低靜電效應(yīng)，減少探針對組織的非特異性背景染色。有的作者除在室溫下浸于上述溶液10min外，還在預(yù)熱37℃的50%甲酰胺/2×SSC液中預(yù)雜交15min，然后用2×SSC，0.30mol/LNaAc/0.030mol/L枸櫞酸鈉液中浸15min。但Heinz、Hofer等一些著名學(xué)者卻對此持有異議，根據(jù)他們的實驗和經(jīng)驗證明，乙酸酐和三乙醇胺液的處理并不能起到減低背景的目的，不能改善ISHH的信/噪比例。
3．減低背景染色。和免疫細(xì)胞化學(xué)染色一樣ISHH實驗程序中，如何減低背景染色是一個重要的問題。ISHH中背景染色的形成是諸多因素構(gòu)成的。雜交后（Posthybridization）的酶處理和雜交后的洗滌均有助于減低背景染色。預(yù)雜交（Prehybridization）是減低背景染色的一種有效手段。預(yù)雜交液和雜交液的區(qū)別在于前者不含探針和硫酸葡聚糖（Dextransulphate）。將組織切片浸入預(yù)雜交液中可達到封閉非特異性雜交點的目的，從而減低背景染色。有的實驗室在雜交后洗滌中采用低濃度的RNA酶溶液（20μg/ml）洗滌一次，以減低殘留的和內(nèi)源性的RNA酶，減低背景染色。
4．防止RNA酶的污染。由于在手指皮膚及實驗用玻璃器皿上均可能含有RNA酶，為防止其污染影響實驗結(jié)果，在整個雜交前處理過程都需戴消毒手套。所有實驗用玻璃器皿及鑷子都應(yīng)于實驗前一日置高溫（240℃）烘烤以達到消除RNA酶的目的。要破壞RNA酶，其最低溫度必須在150℃左右。有條件的國外實驗室在消毒的玻璃器皿外包以錫箔紙以利于標(biāo)記和防止取出時空氣污染。在無高溫消毒的烤箱時，亦可用國內(nèi)出產(chǎn)的衛(wèi)生蒸汽消毒鍋（山東新華醫(yī)療器材廠生產(chǎn)）。雜交前及雜交時所應(yīng)用的溶液均需經(jīng)高壓消毒處理。
過程
雜交（Hybridisation），在ISHH，整個實驗周期是比較長的，實驗程序也比較繁雜，而雜交在ISHH整個實驗中可被認(rèn)為是“短兵相接”的一步。雜交前的一切準(zhǔn)備工作如增加組織通透性都是為了在雜交這一步驟中核酸探針能進入細(xì)胞或組織與其內(nèi)的靶核苷酸相結(jié)合。因此，雜交是ISHH中關(guān)鍵的而且是最重要的一個環(huán)節(jié)。
雜交是將雜交液滴于切片組織上，加蓋硅化的蓋玻片。國內(nèi)向正華等采用無菌的蠟?zāi)ご婀杌纳w玻片也可獲得滿意的實驗結(jié)果。加蓋片的目的是防止孵育過程中的高溫（50℃左右）導(dǎo)致雜交液的蒸發(fā)。因此，也有為穩(wěn)妥起見，在蓋玻片周圍加液體石蠟封固的，但作者認(rèn)為這并不十分必要，因封固的石蠟在高溫下融解反易導(dǎo)致雜交液的污染，必要時可加橡皮泥封固蓋片四周。硅化的蓋玻片的優(yōu)點是清潔無雜質(zhì)，光滑不會產(chǎn)生氣泡和影響組織切片與雜交液的接觸，蓋玻片自身有一定重量能與有限的雜交液吸附達到覆蓋和防止蒸發(fā)的作用。在孵育時間較長時，為保證雜交所需的濕潤環(huán)境，可將復(fù)有硅化蓋玻片進行雜交的載片放在盛有少量5×SSC或2×SSC（standardsalinecitrate,SSC）溶液的硬塑料盒（要能防止高溫破壞）中進行孵育。雜交液的成分和預(yù)雜交液基本相同，所不同的是加入了標(biāo)記的核酸探針和硫酸葡聚糖。
如前所述，雜交前的準(zhǔn)備只是為雜交的成功奠定基礎(chǔ)，要獲得滿意的實驗結(jié)果，在雜交這一實驗過程中還須注意以下的環(huán)節(jié)。
①探針的濃度。很難事先確定每一種實驗探針的濃度，但要掌握一個原則，即探針濃度必須給予該實驗最大的信/噪比值。背景染色的高低也與探針濃度有關(guān)。根據(jù)國內(nèi)外實驗工作者的經(jīng)驗，認(rèn)為最佳原則應(yīng)是應(yīng)用最低探針濃度以達到與靶核苷酸的最大飽和結(jié)合度為目的。這和我們在免疫細(xì)胞化學(xué)試驗中選擇抗血清的最佳工作濃度的原則一樣。探針濃度依其種類和實驗需要略有不同，根據(jù)筆者的經(jīng)驗及所查閱文獻，在原位雜交細(xì)胞化學(xué)中，探針濃度為0.5～5.0μg/ml（即0.5～5.0ng/μl）。
根據(jù)Heinz、Hofelt實驗室經(jīng)驗，對放射性標(biāo)記的dsDNA或cRNA探針，其濃度在2～5ng/μl。Conlton認(rèn)為生物素標(biāo)記探針，其最佳濃度在0.5～5ng/μl。作者在英皇家研究生院Polak教授實驗室應(yīng)用于放射性標(biāo)記cRNA探針的濃度為0.5ng/μl，而在非放射性標(biāo)記（生物素或地高辛）cRNA探針濃度為2.5ng/μl，放射性標(biāo)記DNA探針濃度為1.0ng/μl。向正華等應(yīng)用地高辛標(biāo)記生長抑素cRNA探針獲得滿意結(jié)果，其探針濃度為0.5ng/μl。必須強調(diào)的是，國內(nèi)外實驗室都證明加雜交液的量要適當(dāng)，以10～20μl/每張切片為宜。雜交液過多不僅造成浪費，而且液量過多常易致蓋玻片滑動脫落，影響雜交效果，過量的雜交液含核酸探針濃度過高，反易導(dǎo)致高背景染色等不良后果。
②探針的長度。一般應(yīng)用于ISHH探針的最佳長度應(yīng)在50～100個堿基之間。探針短易進入細(xì)胞，雜交率高，雜交時間短。據(jù)報告，長500個堿基的探針，其雜交時間約需20h左右。200～500個堿基的探針仍可應(yīng)用，如超過500個堿基的探針則在雜交前最好用堿或水解酶進行水解，使其變成短的片段，達到實驗所需求的堿基數(shù)。
③雜交的溫度和時間。雜交的溫度也是雜交成功與否的一個重要環(huán)節(jié)。在第十八章概述中曾提到DNA或RNA需加熱或變性、解鏈后才能進行雜交。能使50%的核苷酸變性解鏈所需的溫度，叫解鏈溫度或融解溫度（meltingtemperature,簡稱Tm）。原位雜交中，多數(shù)DNA探針需要的Tm是90℃，而RNA則需要95℃。這種高溫對保存組織形態(tài)完整和保持組織切片粘附在載玻片上是不可能的。因此，在雜交的程序中常規(guī)的加入30%～50%甲酰胺（for－mamide）于雜交液中。McConaughy報告，反應(yīng)液中每增加1%的甲酰胺濃度，Tm值可降低0.72℃。因此，可用調(diào)節(jié)鹽濃度的辦法來調(diào)節(jié)Tm。Tm的計算公式在第十九章有介紹，由公式的列出也表明了它與鹽的濃度、探針的長度、甲酰胺的百分比等諸多因素有關(guān)。
由于鹽和甲酰胺濃度的調(diào)節(jié)等因素，實際采用的原位雜交的溫度在Tm-25℃左右，即比Tm減低25℃，大約在30～60℃之間，根據(jù)探針的種類不同，溫度略有差異，RNA和cRNA探針一般在37～42℃左右，而DNA探針或細(xì)胞內(nèi)靶核苷酸為DNA的，則必須在80～95℃加熱使其變性，時間5～15min，（有作用報告在105℃微波爐加熱使之變性），然后在冰上擱置1min，使之迅速冷卻，以防復(fù)性，再置入盛有2×SSC的溫盒內(nèi)，在37～42℃孵育雜交過夜。雜交的時間如過短會造成雜交不完全，而過長則會增加非特異性染色。從理論上講，核苷酸雜交的有效反應(yīng)時間在3h左右。Barns等（1987）報告用DNA探針雜交，其反應(yīng)完成時間為2～4h。但為穩(wěn)妥起見，一般將雜交反應(yīng)時間定為16～20h，或為簡便起見雜交孵育過夜，從現(xiàn)有文獻報告看無不良結(jié)果。當(dāng)然，雜交反應(yīng)的時間與核酸探針長度與組織通透性有關(guān)，在確定雜交反應(yīng)時間應(yīng)予考慮，并經(jīng)反復(fù)實驗確定。有作者主張雜交反應(yīng)的孵育應(yīng)在黑暗環(huán)境中進行，因為光線會促進甲酰胺的電離作用。
④雜交嚴(yán)格度（Hybridizationstringency）。雜交條件的嚴(yán)格度（stringency）表示通過雜交及沖洗條件的選擇對完全配對及不完全配對雜交體的鑒別程度。錯配對(mismatch)雜交的穩(wěn)定性較完全配對雜交體差，因此，通過控制雜交溫度、鹽濃度等，可減弱非特異性雜交體的形成，提高雜交的特異性。所以，雜交的條件愈高，特異性愈強，但敏感性降低，反應(yīng)亦然。一般來說，低嚴(yán)格度（lowstringency）雜交及沖洗條件在Tm-35℃至Tm–40℃之間，高鹽或低甲酰胺濃度。在這種條件下，大約有70%～90%的同源性核苷酸序列被結(jié)合，其結(jié)果是導(dǎo)致非特異性雜交信號的產(chǎn)生。中嚴(yán)格度，Tm-20℃至Tm-30℃的范圍。高嚴(yán)格度（highstringency）為Tm-10℃至Tm-15℃，低鹽和高甲酰胺濃度。
在這種條件下，只有具有高同源性的核苷酸序列才能形成穩(wěn)定的結(jié)合。麥躍行裝用地高辛標(biāo)記原位雜交技術(shù)檢測尖銳濕疣中人乳頭瘤病毒DNA型別，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在嚴(yán)格條件下（Tm-12℃）各型病毒DNA的檢出率和陽性率明顯低于非嚴(yán)格條件下（Tm-35℃），其相差非常明顯（P<0.001）。因為，在嚴(yán)格條件下只有同源性很強的DNA才被檢出，而在非嚴(yán)格條件下同源性較低的DNA序列也被檢出。因此，他建議對病毒DNA分型需在高嚴(yán)格條件下進行，而低嚴(yán)格條件則可用于對病毒感染進行篩選。由于原位雜交技術(shù)多數(shù)是在Tm-25℃進行的，不屬于高嚴(yán)格范圍，無疑會產(chǎn)生非特異性結(jié)合導(dǎo)致信/噪比減低。在這種情況下，可用加強雜交后處理洗滌的嚴(yán)格度使非特異性的雜交體減少。
由于RNA雜交的穩(wěn)定性，應(yīng)用cRNA探針進行細(xì)胞或組織的原位雜交時的雜交溫度比其它核酸探針要高10～15℃。實驗證明，cRNA產(chǎn)生的信號比雙鏈cDNA要強。單鏈的RNA探針其雜交信號大于雙鏈的cDNA的約8倍。
⑤硫酸葡聚糖（Dextransulphate）和甲酰胺（formamide）。硫酸葡聚糖是核酸雜交液中僅次于甲酰胺的一種組成成份。在雜交液中，甲酰胺占50%左右，而硫酸葡聚糖占10%左右。它是一種大分子的多聚胺化合物，具有極強的水合（hydrate）作用，因而能大大增加雜交液的粘稠度。硫酸葡聚糖的主要作用是促進雜交率，特別是對雙鏈核酸探針。這是應(yīng)用硫酸葡聚糖于雜交液中的主要目的。甲酰胺的主要作用在上節(jié)已提及，在調(diào)節(jié)雜交反應(yīng)溫度方面，甲酰胺起了極為重要的作用，從而有助于保持組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)。甲酰胺還可防止在低溫時非同源性片段的結(jié)合，但甲酰胺具有破壞氫鍵的作用從而具有一種不穩(wěn)定的作用。
后處理
雜交后處理包括系列不同濃度，不同溫度的鹽溶液的漂洗。在原位雜交組織化學(xué)的實驗程序中，這也是一個重要的環(huán)節(jié)。特別因為大多數(shù)的原位雜交實驗是在低嚴(yán)格度條件下進行的，非特異性的探針片段粘附在組織切片上，從而增強了背景染色。RNA探針雜交時產(chǎn)生的背景染色特別高，但能通過雜交后的洗滌有效地減低背景染色，獲得較好的反差效果。在雜交后漂洗中的RNA酶液洗滌能將組織切片中非堿基配對RNA除去。洗滌的條件如鹽溶液的濃度、溫度、洗滌次數(shù)和時間因核酸探針的類型和標(biāo)記的種類不同而略有差異，一般遵循的共同原則是鹽溶液濃度由高到低而溫度由低到高。必須注意的是在漂洗的過程中，切勿使切片干燥。干燥的切片即使大量的溶液漂洗也很難減少非特異性結(jié)合，從而增強了背景染色。放射性標(biāo)記探針雜交后漂洗過程中可用底片曝光的方法檢測背景染色（非特異性標(biāo)記的多少）作為改善漂洗程序的指針。在35S標(biāo)記的核酸探針在漂洗液中須加入14mmol/L的β-巰基乙醇（β-mercaptoethanol）或硫代硫酸鹽（thiosulphate），以防止35S標(biāo)記的核酸探針被氧化。總之，如何控制漂洗的嚴(yán)格度從而達到理想的信/噪比無既定方案可循，必須從反復(fù)的實踐中取得經(jīng)驗。
顯示
顯示又可稱為檢測系統(tǒng)（Detectionsystem）。根據(jù)核酸探針標(biāo)記物的種類分別進行放射自顯影或利用酶檢測系統(tǒng)進行不同顯色處理。細(xì)胞或組織的原位雜交切片在顯示后均可進行半定量的測定，如放射自顯影可利用人工或計算機輔助的圖象分析檢測儀（computer–assistedimageanalysis）檢測銀粒的數(shù)量和分布的差異。非放射性核酸探針雜交的細(xì)胞或組織可利用酶檢測系統(tǒng)顯色，然后利用顯微分光光度計或圖像分析儀對不同類型和數(shù)量的核酸的顯色強度進行檢測。但利用ISHH做半定量測定必須注意嚴(yán)格控制實驗的同一條件，切片的厚度和核酸的保存量如取材固定的間隔時間等。如為放射自顯影，核乳膠膜的厚度與稀釋度等必須保持一致。
例子
對分散在若干個瓊脂平板上的少數(shù)菌落（100-200）進行克隆篩選時，可采用該方法。將這些菌落歸并到一個瓊脂主平板以及已置于第二個瓊脂平板表面的一張硝酸纖維素濾膜上。經(jīng)培養(yǎng)一段時間后，對菌落進行原位裂解。主平板應(yīng)貯存于4℃直至得到篩選結(jié)果。
1.將少數(shù)菌落轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上
(2)用無菌牙簽將各個菌落先轉(zhuǎn)移至濾膜上，再轉(zhuǎn)移至含有選擇性抗生素但未放濾膜的瓊脂主平板上。應(yīng)按一定的格子進行劃線接種（或打點）。每菌落應(yīng)分別劃線于兩個平板的相同位置上。最后，在濾膜和主平板上同時劃一個含有非重組質(zhì)粒（如pBR322）的菌落。
(5)用Parafilm膜封好主平板，倒置貯放于4℃，直至獲得雜交反應(yīng)的結(jié)果。
(6)裂解細(xì)菌，按本段下面所述方法，使釋放的DNA結(jié)合于硝酸纖維素濾膜。
2.菌落的裂解及DNA結(jié)合于硝酸纖維素濾膜
（1)在一張保鮮膜上制作一個裝有0.5mol/LNaOH的小洼（0.75ml），使菌落面朝上，將濾膜放到小洼上，展平保鮮膜，使濾膜均勻濕潤，讓濾膜留于原處2-3分鐘。 (2)用干紙巾從濾膜的下方吸干濾膜，用一張新的保鮮膜和新配制的0.5mol/LNaOH重復(fù)步驟（1）。
(3)吸干濾膜，將濾膜轉(zhuǎn)移到新的帶有1mol/LTris·Cl(pH7.4）的保鮮膜洼上。5分鐘后吸干濾膜，再重復(fù)一次該步驟。
(4)吸干濾膜，把它轉(zhuǎn)移到有1.5mol/LNaCl、0.5mol/LTris·Cl(pH7.4）的保鮮膜小洼上5分鐘后吸干濾膜，轉(zhuǎn)移到一張干的濾紙上，置于室溫20-30分鐘，使濾膜干燥。 (5)將濾膜夾在兩張干的濾紙之間，在真空烤箱中于80℃干烤2小時，固定DNA。
(6)將固定在膜上的DNA與32P標(biāo)記的RNA進行雜交。
3.雜交
(2)將濾膜轉(zhuǎn)到200ml預(yù)洗液的玻璃皿中。濾膜何疊在一起，放于溶液中。用保鮮膜蓋住玻璃皿，放到位于培養(yǎng)箱內(nèi)的旋轉(zhuǎn)平臺上。于50℃處理30分鐘。在這一步及以后的所有步驟中，應(yīng)緩緩搖動濾膜，防止它們粘在一起。
(3)用泡過預(yù)洗液的吸水棉紙輕輕地從膜表面拭去細(xì)菌碎片，以降低雜交背景而不影響陽性雜交信號的強度和清晰度。
(4)將濾膜轉(zhuǎn)到盛有150ml預(yù)雜交液的玻璃中，在適宜溫度（即在水溶液中雜交時用68℃，而在50%甲酰胺中雜交時用42℃）下，預(yù)雜交1-2小時。
(5)將32P標(biāo)記的雙鏈DNA探針于100℃加熱5分鐘，迅速置于冰浴中。單鏈探針不必變性。將探針加到雜交袋中雜交過夜。雜交期間，盛濾膜的容器應(yīng)蓋嚴(yán)，以防液體蒸發(fā)。
(6)雜交結(jié)束后，去除雜交液，立即于室溫把濾膜放入大體積（300-500ml）的2×SSC和0.1%SDS溶液中，輕輕振搖5分鐘，并將濾膜至少翻轉(zhuǎn)一次。重復(fù)洗一次，同時應(yīng)避免膜干涸。
(7)68℃用300-500ml1×SSC和0.1%SDS溶液洗膜兩次，每次1-1.5小時。此時已可進行放射自顯影。如背景很高或?qū)嶒炓髧?yán)格的洗膜條件，可用300-500ml0.2×SSC和0.1%SDS的溶液于68℃將濾膜浸泡60分鐘。
(8)把濾膜放在紙巾上于室溫晾干后，把濾膜（編號面朝上）放在一張保鮮膜上，并在保鮮膜上作幾個不對稱的標(biāo)記，以使濾膜與放射性自顯影片位置對應(yīng)。
(9)用第二張保鮮膜蓋住濾膜。加X光片并加上增感屏于-70℃曝光12-16小時。
(10)底片顯影后，在底片上貼一張透明硬紙片。在紙上標(biāo)記陽性雜交信號的位置，同時在不對稱分布點的位置上作出標(biāo)記。可從底片上取下透明紙，通過對比紙上的點與瓊脂上的點來鑒定陽性菌落。
試驗
收集斑馬魚的胚胎，在Holfretor水中培養(yǎng)，到達所需要的發(fā)育時期時，用蛋白酶去除卵膜，用4%多聚甲醛固定，在4℃保存，二十四小時后用50%甲醇2%多聚甲醛溶液洗，然后換成甲醇，在-20C保存，待用(兩天和兩天以上的胚胎需要用雙氧水處理，去除色素?；蛘呤褂帽?/span>锍脲稀溶液培養(yǎng)，可阻斷色素的形成)
一.原位雜交第一天
1.重新水化和固定
1）吸取固定好的胚胎，加入50%甲醇的PBST溶液，放置5分鐘。
2）置換成30％甲醇的PBST溶液，放置5分鐘
3）置換成PBST溶液，放置5分鐘，重復(fù)一次
4）置換成4％多聚甲醛的PBS溶液固定20分鐘
5）用PBST洗兩次，每次放置五分鐘，室溫。
蛋白酶處理與后固定（本實驗不做此步）
1）用10ul/ml的蛋白酶K在室溫下處理胚胎。5體節(jié)以下的胚胎不處理，5體節(jié)到24小時的胚胎處理3分鐘，24小時以上的胚胎處理5分鐘或者更長。發(fā)育時間越短的胚胎越嫩，可以不用或者少用蛋白酶處理，發(fā)育時間長的胚胎就需要用蛋白酶來疏松組織，以便于雜交。
2）用PBST溶液輕洗，在PBST中放置5分鐘。
3）用4％多聚甲醛的PBS溶液固定20分鐘，室溫。
4）用PBST洗兩次，每次放置五分鐘，室溫。
2.預(yù)雜交
1）每個管中置換成大約300ulHYB－溶液，60℃水浴5分鐘，避免振蕩。
2）用等體積的HYB＋取代HYB－。
3）60℃水浴，預(yù)雜交4小時以上。
3.雜交
1）吸去預(yù)雜交的HYB＋，加上100ul已加入探針的HYB＋溶液（探針濃度約為1ng/ul）..
2）60℃溫浴過夜。
注：雜交與預(yù)雜交的溫度可以是55到60度不等，溫度越低，探針結(jié)合越好，溫度越高，背景越小。
二.原位雜交第二天
1.
1）將探針回收，放于－20C保存(通常探針可重復(fù)使用十次左右)。
2）加入50%甲酰胺/2XSSCT溶液1毫升，60℃，放置30分鐘，重復(fù)一次。
3）置換2XSSCT1ml，60℃，放置15分鐘。
4）置換0.2XSSCT1ml，60℃，放置30分鐘，重復(fù)一次。
2.
1）用MABT洗兩次，每次五分鐘，放在搖床輕輕搖動。
2）室溫下加1ml1：2：7溶液，時間為一小時。
3）按1：3000的比例在1：2：7溶液中加入酶連地高辛抗體，4C冰箱過夜。
三.原位雜交第三天
2）用1ml1mM左旋米睉的Stainingbuffer洗三次，每次放置五分鐘。
3）將胚胎轉(zhuǎn)入十六孔板中，吸去stainingbuffer，加上300ulBMPurpleAPSubstrate(底物，用之前加5mM左旋米唑)，十六孔板外面包上錫箔紙以避光，避免搖動，室溫下顯色。
4）每隔一小時觀察胚胎是否開始顯色
5）將顯色完全的胚胎中的底物吸出，用PBST洗兩三次后加上4％多聚甲醛固定，拍照。
6）4C冰箱保存。
原位雜交中溶液的配制：
PBS:
NaCl8g
KCl0.2g
Na2HPO41.44g
KH2PO40.24g
原位雜交
DEPCH2O1L
HCl調(diào)PH值至7.4
抽濾，滅菌
4%多聚甲醛：
多聚甲醛40g
PBS1L
加熱持續(xù)攪拌至溶液澄清。-20℃保存
PBST：
20XSSC:
Na3Citrate2H2O88.2g
NaCl175.5g
DEPCH2O至1L
抽濾，滅菌
SSCT：
SSC加上Tween-20使其終濃度為0.1%。
HYB-：
加入Tween-20使其終濃度為0.1%，-20c保存。
HYB+：
HYB-20ml
yeastRNA10mg
heparin1mg。
-20℃保存。
MAB：
maleicacid11.6g
NaCl8.8g
用固體NaOH（約7g）調(diào)至Ph=7.5
4℃保存
MABT
MAB加上Tween-20使其終濃度為0.1%.
10%blockingreagent:
blockingreagent8g
MAB72ml
1：2：7溶液：
滅活羊血清：10%BMblockingreagent：MABT=1：2：7
用時現(xiàn)配
Stainingbuffer：
Tris12.1g
pH9.5
Mgcl6H2O10.2g,
Nacl5.85g
Tween-201ml,
用之前加1M的左旋咪唑儲液，使之終濃度為1mM。
應(yīng)用
意義
原位雜交：在研究DNA分子復(fù)制原理的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種技術(shù)。其基本原理是兩條核苷酸單鏈片段，在適宜的條件下，能過氫鍵結(jié)合，形成DNA-DNA、DNA-RNA或RNA-RNA雙鍵分子的特點，應(yīng)用帶有標(biāo)記的（有放射性同位素，如3H、35S、32P、熒光素生物素、地高辛等非放射性物質(zhì)）DNA或RNA片段作為核酸探針，與組織切片或細(xì)胞內(nèi)待測核酸（RNA或DNA）片段進行雜交，然后可用放射自顯影等方法予以顯示，在光鏡或電鏡下觀察目的mRNA或DNA的存在并定位；用原位雜交技術(shù)，可在原位研究細(xì)胞合成某種多肽或蛋白質(zhì)的基因表達。此方法有很高的敏感性和特異性，可進一步從分子水平來探討細(xì)胞的功能表達及其調(diào)節(jié)機制。已成為當(dāng)今細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)研究的重要手段。
判斷
對照試驗和ISHH結(jié)果判斷，和其它實驗方法一樣，并非ISHH的任何陽性信號都是特異性的，故必須同時有對照試驗以證明其特異性。對照試驗的設(shè)置須根據(jù)核酸探針和靶核苷酸的種類和現(xiàn)有的可能條件去選定。從理論上講，對照試驗設(shè)置愈多其靶核苷酸特異性確定愈可靠，但現(xiàn)實是不可能的。因此，在上述對照試驗中應(yīng)任選設(shè)至少3～4種用以證實ISHH結(jié)果的可靠性。在上述試驗中，標(biāo)明*者為比較可靠的對照試驗。
②如果具備相當(dāng)?shù)拿庖呓M化抗血清，可用結(jié)合的免疫組織化學(xué)和ISHH法從蛋白質(zhì)（或多肽）水平和轉(zhuǎn)錄水平在相鄰切片或同一切片中證明同一種多肽和相應(yīng)mRNA共存于同一細(xì)胞中。
③預(yù)先將切片用DNA酶或RNA酶消化，然后用ISHH技術(shù)證明丟失的是DNA或RNA。如同免疫組化的吸收試驗一樣，事先與特異性的cRNA或cDNA進行雜交。再進行ISHH，其結(jié)果應(yīng)為陰性。由于同義RNA探針和組織內(nèi)mRNA序列順序是相同的，應(yīng)用其進行ISHH，結(jié)果應(yīng)為陰性。
④檢測系統(tǒng)的對照如乳膠或酶顯色系統(tǒng)也應(yīng)在無標(biāo)記探針的情況下進行。ISHH的最大優(yōu)點是它的高度特異性，它可測定組織、培養(yǎng)的單個細(xì)胞或細(xì)胞提取物中的核苷酸含量。應(yīng)用高敏感度的放射性標(biāo)記cRNA探針在理想的ISHH的實驗條件下檢測mR－NA，其敏感度可達到20個mRNA拷貝/每個細(xì)胞。由于雙鏈DNA的穩(wěn)定性，在用ISHH定位DNA時很少發(fā)生丟失，降解。在靶核苷酸序列比較伸展的情況如染色體鋪片，長于2kb的探針可以應(yīng)用。因此，其敏感性高到能夠出在染色體鋪片上，有時甚至在組織切片上的單個基因拷貝。正因為如此，對ISHH結(jié)果的解釋應(yīng)持慎重態(tài)度，特別是前人未報告過的新發(fā)現(xiàn)。因為如前所述，影響ISHH實驗結(jié)果的因素太多，比如在外科或?qū)嶒炄〔暮笪醇皶r的固定或冷凍可由于組織中mRNA的降解而導(dǎo)致假陰性結(jié)果。另外，在各種類型核酸探針進入細(xì)胞、組織和各種器官的能力，又叫可接近性（acessiblity）各異。這些諸多因素都將影響ISHH的實驗結(jié)果。
熒光
熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization,FISH）是在20世紀(jì)80年代末在放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種非放射性分子細(xì)胞遺傳技術(shù)，以熒光標(biāo)記取代同位素標(biāo)記而形成的一種新的原位雜交方法，探針首先與某種介導(dǎo)分子（reportermolecule）結(jié)合，雜交后再通過免疫細(xì)胞化學(xué)過程連接上熒光染料，F(xiàn)ISH的基本原理是將DNA（或RNA）探針用特殊的核苷酸分子標(biāo)記，然后將探針直接雜交到染色體或DNA纖維切片上，再用與熒光素分子偶聯(lián)的單克隆抗體與探針分子特異性結(jié)合來檢測DNA序列在染色體或DNA纖維切片上的定性、定位、相對定量分析.FISH具有安全、快速、靈敏度高、探針能長期保存、能同時顯示多種顏色等優(yōu)點，不但能顯示中期分裂相，還能顯示于間期核。同時在熒光原位雜交基礎(chǔ)上又發(fā)展了多彩色熒光原位雜交技術(shù)和染色質(zhì)纖維熒光原位雜交技術(shù).
參考資料
[1]
原位雜交染色[引用日期2014-09-15]
[2]
研域(上海)化學(xué)試劑有限公司[引用日期2012-01-16]
[3]
價值中國網(wǎng)[引用日期2012-01-16]
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卡爾巴拉省是伊拉克的一個省份，位于該國中部。該省面積為5,034平方公里，人口數(shù)量為1,220,005人。省會卡爾巴拉是什葉派伊斯蘭教徒心中的圣城，因此在該省內(nèi)有許多宗教建筑和遺址。該省也是伊拉克重要的文化和歷史中心，擁有豐富的文化遺產(chǎn)和歷史背景。
阿拉伯（阿拉伯語：???????），可指阿拉伯民族，也可指阿拉伯世界。阿拉伯民族起源于閃米特種族，是閃族最年輕的一支，親緣上與希伯來人相近。阿拉伯世界泛指阿拉伯人居住的地區(qū)，阿拉伯世界共有22個國家和地區(qū)。
希伯來語:（????????）是猶太人民族語言，以色列通用語言，為世界上較為古老的語言之一。“希伯來”意為“渡河而來”，屬于閃含語系閃米特語族的一個分支，沒有元音字母，只有22個輔音字母，其文字從右往左書寫。許多希伯來文學(xué)作品和文獻都是用希伯來語寫出來的，主要文獻保留在《死海古卷》和大量猶太教以及基
提比略·愷撒·奧古斯都羅馬帝國第二位皇帝提比略，全名提比略·愷撒·（神君奧古斯都之子·）奧古斯都（拉丁語：Tiberius Caesar Divi Augusti filius Augustus，公元前42年11月16日—公元37年3月16日），原名提比略·克勞狄烏斯·尼祿或提比略·尤里烏斯·愷撒（Tiberius Claudius Nero或Tiberius Julius Caesar），中文又
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這家伙太懶了，什么都沒寫！
作者
