質(zhì)粒制備
1質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和擴增
1.取400uLXL1-Blue菌種加入到含200mlLB培養(yǎng)基的錐形瓶中,37℃、100rpm培養(yǎng)4h,離心,倒置,以冰冷的0.1mol/LCaCl_2重懸細菌,冰浴30min,離心,棄上清,倒置,再加4ml(含15%甘油)冰冷的CaCl2重懸細菌,分裝(200μ/tube),-80℃保存。 2.轉(zhuǎn)化:在冰浴中將1管XL1-Blue感受態(tài)菌解凍,將濃度為2ng/μ1的質(zhì)粒DNA4μ1加入到8Oμ1感受態(tài)菌中。
3.輕輕搖勻,冰浴30min。
4.42℃熱激9O秒,然后迅速冰浴2min。
5.加入LB培養(yǎng)液(無氨芐青霉素)0.8ml,在37℃,100轉(zhuǎn)/min水浴孵育60min。
6.取200μl菌液鋪于瓊脂板上(涂有X-Gal(20mg/ml)-IPTG(200mg/ml)的LB-氨芐青霉素50mg/ml,1μl/ml培養(yǎng)基),待菌液全部被吸收后,倒置平板于37℃培養(yǎng)12-16h。 1.用無菌牙簽挑取單菌落,接種到10ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液的離心管中,于37℃,200轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)2h,取1ml之一EPPENDORF離心管,加50μl10mmol/LEDTA(pH8.0)。 3.在70℃溫育5min,然后冷卻到室溫。
4.加1.5μ14mol/LKCl和0.5μ1含0.4%溴酚蘭染液,振蕩3O秒后,冰浴5min。
5.12000g,4℃離以3min,以除去細菌碎片。
6.制備1%的瓊脂糖凝膠(含EB0.5μg/ml),取50μl上清液加入到樣品孔中,其中一孔加入中等分子量DNAMarker。恒壓50V,進行電泳。 7.當溴酚蘭遷移到凝膠全長的2/3-3/4時,停止電泳,在紫外燈下檢查質(zhì)粒DNA分于量的大小是否與轉(zhuǎn)入質(zhì)粒相符。 1.3質(zhì)粒的擴增和純化
1.用無菌牙簽分別挑取單個白色菌落移入含30mlLB-氨芐青霉素(50μg/ml)培養(yǎng)液的聚丙烯管中,于37℃,200轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)3h。
2.將菌液轉(zhuǎn)入含70mlLB-氨芐青霉素培養(yǎng)液的250ml錐形瓶中,37℃,200轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)過夜(12-16h),細菌渾濁。
3.菌液中加入氯霉素液(34mg溶于lml乙醇,100ml菌液加入0.5ml氯霉素溶液,終濃度為170μ/ml)。37℃,200轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)12-16h。 4.將培養(yǎng)的細菌倒入50ml的離心管中,6000rpm,4℃離,th,15min,沉淀細菌。
5.棄凈上清夜,用2ml預冷的溶液I,懸浮菌體沉淀,劇烈振蕩,于室溫靜置5min
6.加入新配制的溶液II4ml,快速用手晃動10秒,顛倒數(shù)次后,于室溫靜置10min。
7.加入預冷的溶液III3ml,溫和振蕩l0秒,于冰上靜置10min,出現(xiàn)白色絮狀沉淀。
8.6000rpm,4℃離心15min,保留上清。
9.將上清(若帶細菌殘片,則再次離心)移入另一50ml的離心管中,加入0.6倍體積的異丙醇混勻,于室溫靜置10min。(或-20℃4h,或4℃過夜,可便核酸沉淀) 10.12000rpm,4℃離心15min,回收核酸。小心棄去上清,倒置離心管使殘兼上清液流盡。
11.于室溫用70%的乙醇洗滌沉淀物和管壁,室溫12000rpm離心,15min,充分棄去乙醇,于室溫將離心管倒置在紙巾上,使最后殘余的痕量乙醇揮發(fā)殆盡。
12.用500μlTE(pH8.0)溶解核酸沉淀,轉(zhuǎn)移至1.5mlEppendorf管中。
13.加入用冰預冷的5mol/L的LiCl溶液600μl,充分混勻。12000rpm,4℃離心15min,以沉淀高分子量的RNA。
14.將上清轉(zhuǎn)移到另一1.5mlEppendorf管中,加等量異丙醇,充分混勻,于室溫靜置10min。
15.12000rpm,4℃離心15min,回收核酸。小心棄去上清,倒置離心管使殘余上清液流盡。
16.于室溫用70%的乙醇洗滌沉淀物和管壁,室溫12000rpm離心,15min,充分棄去乙醇,于室溫將離心管倒置在紙巾上,使最后殘余的痕量乙醇揮發(fā)殆盡。
17.400μl含無DNA酶的RNA酶(20μg/ml)的TE緩沖液(pH8.0)溶解沉淀,將溶液轉(zhuǎn)移到另-1.5mlEppendorf管中,室溫放置1.5mlEppendorf管中30min。 18.加入400μl13%(v/v)的PEG8000-NaCl(1.6mol/L),混勻,4℃12000rpm離心5min以回收質(zhì)粒DNA,棄去上清。 19.加入400μlTE緩沖液(pH8.O)溶解沉淀,再分別用等體積的Tris飽和酚、酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)、和氯仿各抽提一次。 20.將水相(上清)移入另一1.5mlEppendorf管中,加入O.1體積(約50μ13M的醋酸鈉(pH5.2)和2倍體積(大約1ml)的無水乙醇,充分混勻后于4℃放置30min。 21.于4℃12000rpm離心5min回收沉淀的質(zhì)粒DNA。盡可能棄去上清,敞開管口,置工作臺上使殘留的痕量乙醇蒸發(fā)殆盡。
22.加入400μl處于4℃的70%乙醇,稍加振蕩,漂洗沉淀,4℃12000rpm離心2min。
23.吸去上清,室溫敞開管口,直到乙醇完全揮發(fā)。
24.用100μlTE緩沖液(pH8.0)溶解沉淀。
25.取4μl溶液1:100稀釋后,測定其OD260、OD280,以確定質(zhì)粒DNA的純度和濃度(OD260/OD280>1.8。OD260/OD280對DNA而言其值大約為
1.8,高于2.0則可能有RNA污染,低于1.8則有蛋白質(zhì)污染。;DNA濃度=OD260X0.05X稀釋倍數(shù)(μg/μl)。 26.質(zhì)粒DNA溶液于-20℃保存待用。