從本節(jié)開始,我們開始對膜進(jìn)行深入討論和談一些應(yīng)用技巧。
1. 蛋白與膜的結(jié)合原理
蛋白與膜的結(jié)合原理,已知的結(jié)合力包括疏水作用力\H鍵\靜電作用力等,確切的結(jié)合原理并不明確,主要靠假說來支撐。主要有兩種假說: 1)首先兩者靠靜電作用力結(jié)合,然后靠H鍵和疏水作用來維持長時間結(jié)合。 2)首先兩者靠疏水作用結(jié)合,然后靠靜電作用來維持長時間結(jié)合。 兩條假說,都表明其結(jié)合過程分為兩步,首先結(jié)合和后面長時間結(jié)合。由于結(jié)合原理的不明確性,導(dǎo)致在這方面的工作非常依賴實踐經(jīng)驗。
2. 膜對結(jié)合的影響
1)膜孔徑
有些技術(shù)人員傾向使用膜孔徑來區(qū)分不同的膜,但是請注意這只僅僅限于同一廠家的產(chǎn)品,如果是不同廠家的產(chǎn)品,這種比較是無意義的。膜孔徑與層析速度的關(guān)系,已在上文描述。隨著膜孔徑減小,膜的實際可用表面積遞增,膜結(jié)合蛋白的量也遞增. 估量表面積的參數(shù)為表面積比率(實際可用表面積與所用膜平面積的比率)。 另外,膜孔徑越小,層析速度也越小,那么金標(biāo)復(fù)合物通過T線的時間也就越長,反應(yīng)也就越充分。
綜合以上兩點,結(jié)論為膜孔徑越小靈敏度越高。但是同時也減慢了跑板速度,增加了非特異性結(jié)合的機(jī)會,也就是假陽性越高。所以要按照試驗結(jié)果挑選適合實際項目的膜,找到合適的平衡點。 2)不同廠家的膜差異
這個差異主要來源于兩點:
1> 生產(chǎn)膜時,使用的聚合物和表面活性劑的來源,類型,數(shù)量不同。同理,在膜處理中這兩類物質(zhì)一般會對性能產(chǎn)生較大影響。 2> 處理過程不同。
3. 生物原料,緩沖溶液的試劑和配方
1)生物原料,作為CT線的生物原料使用情況各異,所以這里只做略述。
首先,單克隆抗體與膜的結(jié)合優(yōu)于多克隆抗體,主要時由于多克隆抗體有很多不同的表面位點,而各位點與膜的最佳結(jié)合條件都有細(xì)微的差別,毫無疑問就增加了優(yōu)化難度。其次,分子量越大,蛋白越難結(jié)合到固相材料上。 大家最關(guān)心的可能就是希望獲得一個性能優(yōu)良的配方,包括緩沖液,封閉液等等處理溶液配方。 其實我也無法提供給你一個萬用配方清單。因為不同的反應(yīng)體系需要不同的配方來支持,而不同機(jī)構(gòu)的反應(yīng)體系又有差異。想獲”魚”先學(xué)”漁”.。為了不誤導(dǎo)大家,我在下面涉及到配方的問題上,僅提供思路,具體配方請自己摸索。
緩沖液的構(gòu)成一般是:PBS(或其他緩沖體系)+作用物質(zhì)(針對某一特定問題)+PH調(diào)整. 我在參考過以前的各種資料后,個人意見為配方原則為宜簡不宜繁,根據(jù)自己的需要添加作用物質(zhì),原來的很多需要添加的作用物質(zhì),由于膜制造技術(shù)的改進(jìn)已經(jīng)不再需要。
推薦的緩沖體系為0.01M PBS PH7-7.2,該緩沖體系對多種抗原抗體都有良好的適應(yīng)性。 作用物質(zhì)的情況大致羅列如下:
少量NACL,減少信號強(qiáng)度,消假陽。
有機(jī)醇(甲醇,異丙醇等),潤濕膜,減少膜帶有的靜電,利于結(jié)合包被。個人不推薦,因制膜工藝改進(jìn)。 表面活性劑(TW20,TX100),增加親水力,可避免線條中空現(xiàn)象,也可增色。
糖,保護(hù)劑,減緩老化速度,也可以增加親水力同上。
調(diào)PH到某個位置,可以消假陽。
4. 點樣環(huán)境
環(huán)境濕度對點膜過程非常重要。最佳濕度一般在45-65%。濕度過低,膜上容易聚集靜電荷,點膜容易出現(xiàn)散點,導(dǎo)致測試會出現(xiàn)疏水斑。濕度過高,膜上毛細(xì)作用加強(qiáng),點膜容易引起CT線變寬甚至擴(kuò)散。為了保證點樣時膜濕度的均一性,一般在點樣前把膜放到該濕度條件下平衡一段時間。 5. 點樣儀器與膜面情況的關(guān)系
目前有兩種點樣方式,劃膜式和非接觸點膜式。非接觸點膜式優(yōu)于劃膜式,進(jìn)口劃膜式優(yōu)于國產(chǎn)劃膜式。
因劃膜式為軟管將抗體劃到膜表面,而膜本身的物理性質(zhì)為軟脆,劃管會在其表面留下印痕。進(jìn)口的劃膜機(jī)由于使用的材料和控制系統(tǒng)較好,所以留下的劃痕較輕,而國產(chǎn)儀器較差,留下的劃痕也就比較嚴(yán)重。劃痕容易對層析的金標(biāo)復(fù)合物形成阻力,導(dǎo)致假陽性。同時容易出現(xiàn)跑板時在T線位置出現(xiàn)若有若無一條細(xì)線(鬼線),而跑板結(jié)束后鬼線消失的奇怪現(xiàn)象。 6. 膜的寬度與點樣位置
膜的寬度一般有18mm(or 20mm)和25mm兩種,分別使用在做測試條和做測試板上。然而,不同的T線點樣位置將帶來不同的靈敏度。點樣位置上移,金標(biāo)復(fù)合物通過T線位置時速度變慢,反應(yīng)時間增加,靈敏度升高。反之靈敏度降低。這個方法可以用來改變靈敏度和消除假陽性。
7. 溶液在膜上的擴(kuò)散
溶液在膜上的點樣量一般情況下為1ml/cm。溶液在膜上的擴(kuò)散是趨向兩端的,噴點上去的是均勻的抗體溶液,但當(dāng)干燥時線條邊緣的干燥速度高于中間,中間的抗體會不斷向兩邊擴(kuò)散,所以干燥后抗體是向線條的兩端聚集的。一般情況下不影響你的試驗。如果你發(fā)現(xiàn)線條出現(xiàn)兩端紅,中間淡的現(xiàn)象,就要考慮這個問題了。可以加如上面說的作用物質(zhì)來解決。
8. 點膜前后的封閉作用
從供應(yīng)商處購買回的膜基本上都是已經(jīng)優(yōu)化處理好的,直接點膜就可使用。然而我們還是經(jīng)常會遇到關(guān)于封閉的討論。其實封閉不象大家認(rèn)為的那樣,一封閉什么問題都解決了. 老問題走了新問題又來了,而且更麻煩,我要說的是慎用封閉。我極其反對點膜前封閉的做法。原因為廠家在生產(chǎn)膜時候,各種配方是混合加入原漿的。而點膜前封閉時要將膜浸泡在封閉液內(nèi),必然擾亂了膜內(nèi)正常的物質(zhì)分布。由此引發(fā)了許多問題,也降低了工作效率。也有廠家遇到不封閉就無法包被上膜的問題,其實可以通過其他辦法來解決,封閉必然是下測。
我經(jīng)常使用的封閉手法有兩種:流動封閉,將作用物質(zhì)處理在樣品墊上。膜上定點封閉,將作用物質(zhì)配成溶液噴點在膜的特定位置上。該方法需要使用BIODOT的AIRJET噴頭,可以將不合格的半成品大板重新復(fù)活。只要是將封閉做在了膜上,就必然會對產(chǎn)品的穩(wěn)定性造成影響,具體的影響程度要通過穩(wěn)定性測試來評判。
9. 膜的儲存
剛生產(chǎn)出的膜一般含有5-10%的水分。關(guān)于膜的老化機(jī)理,有個理論支持,不過爭議比較大。理論認(rèn)為:膜的老化是因為膜上的水分蒸發(fā),使膜變得疏水,帶電荷并變脆。儲存膜一般要求是避光,密封,過干或過濕都不利。在這種保存條件下,一般可以放置兩年。但是如果膜上做了封閉處理,就要根據(jù)具體試驗情況來判斷了。有些膜由于生產(chǎn)工藝的問題,使用后靈敏度會在一段時間內(nèi)發(fā)生變化,遇到這種問題,就需要在點膜后放置一段時間,待穩(wěn)定后方可進(jìn)入調(diào)試生產(chǎn)。
硝酸纖維素膜NC膜
規(guī)格: 15X20cm
孔徑: 0.45μm
保存: 5-15℃密封保存,保質(zhì)期一年
產(chǎn)品簡介: 本品外觀潔白,膜正面呈光澤,與水接觸應(yīng)立即浸潤,不能立即浸潤老者視為失活,不能點樣,膜面有花斑或有粉性結(jié)構(gòu)皆視為次品。用于轉(zhuǎn)移電泳,宜選孔經(jīng)0.22或0.45,以保證膜的強(qiáng)度,并減少穿透損失,硝纖膜過份干燥時脆,濕時有彈性,操作時室內(nèi)應(yīng)保持中常溫度,避免過份干燥,防止發(fā)脆,本品靜電吸附膜的親水性好,滲濾時間適中,蛋白吸附力強(qiáng),轉(zhuǎn)膜的蛋白集中而不擴(kuò)散,顯色的靈敏度和特異性高,背景低。