測(cè)定方法

出血時(shí)間測(cè)定有三種方法：即，Duke法、Ivy法、出血時(shí)間測(cè)定器法。

Duke法

Ivy法

出血時(shí)間沉定器法

臨床意義

1.

2.

3.

時(shí)間測(cè)定

凝血時(shí)間試驗(yàn)是指血液自血管抽出放入試管中，從液態(tài)的溶膠狀態(tài)轉(zhuǎn)為半固體凝膠狀態(tài)所需要的時(shí)間。出血后，血液(或血漿)中的Ⅻ因子被激活后，處于酶原狀態(tài)的凝血因子Ⅻ,Ⅺ,Ⅸ,Ⅷ,Ⅹ,Ⅴ依次被激活，連續(xù)"放大"，最終使纖維蛋白原生成纖維蛋白。后者呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)羅血小板栓子和紅細(xì)胞后，收縮形成牢固的血塊。這一過程需要Ⅻ、Ⅺ、Ⅸ、Ⅷ、Ⅹ、Ⅴ、Ca2+、凝血酶原及纖維蛋白原等凝血因子的參與，其中任一因子缺乏均可引起上述"連續(xù)放大"過程障礙，造成凝血不良。因此凝血時(shí)間延長(zhǎng)，可反映上述因子缺乏。此試驗(yàn)反映記錄的是整個(gè)凝血過程，對(duì)Ⅺ,Ⅸ,Ⅷ因子較為敏感，只有凝血酶原,凝血因子X,纖維蛋白原明顯減低時(shí)才顯示實(shí)驗(yàn)結(jié)果延長(zhǎng)。

凝血時(shí)間實(shí)驗(yàn)大致有6種測(cè)定方法。王鴻利等用6種凝血時(shí)間測(cè)定對(duì)12例重型血友?。á蜃踊钚?1%），4例中型血友病（Ⅷ因子活性1%~5%）進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果（檢出率/病例數(shù)）為：毛細(xì)血管法，重型1/12，中型0/4；玻片法，重型2/12，中型0/4；普通試管法，重型12/12，中型2/4；APTT，重型12/12，中型4/4；硅化管，重型12/12，中型4/4；ACT法，重型12/12，中型4/4。從中可以看出，毛細(xì)血管法和玻片法很不敏感，不能再用于Ⅺ、Ⅸ、Ⅷ因子的篩選實(shí)驗(yàn)。普通試管法簡(jiǎn)單且較敏感，標(biāo)本用量較少，可用于常規(guī)檢查，但由于手工操作，需注意實(shí)驗(yàn)器材的標(biāo)準(zhǔn)化。APTT簡(jiǎn)便快速，市面上有各型凝血儀，可用于不同規(guī)模實(shí)驗(yàn)室，且有配套的試劑、質(zhì)控物、校準(zhǔn)物，易于質(zhì)量控制，是較理想的常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法。APTT也可手工完成，但影響因素較多，在標(biāo)本量較多時(shí)，不適用。

臨床意義

1.

2.

指標(biāo)診斷

為了避免術(shù)中出血，手術(shù)前進(jìn)行出血傾向的檢查非常必要，由于影響止血的因素很多，但又不可能做許多實(shí)驗(yàn)，因此，以往常規(guī)中用出血時(shí)間和凝血時(shí)間作為診斷指標(biāo)，結(jié)果異常時(shí)再進(jìn)一步做較復(fù)雜的試驗(yàn)尋找病因。前已述及,Duke法雖簡(jiǎn)單適于常規(guī)應(yīng)用，但敏感性很差，不能達(dá)到診斷要求，而出血時(shí)間測(cè)定器方法，操作復(fù)雜，費(fèi)時(shí)，不適合常規(guī)使用。雖是反映血管，血小板數(shù)量和質(zhì)量方面的病理變化，但臨床最常見的是血小板減少引起變化。而血管性疾病和血小板質(zhì)量異常引起的疾病多是遺傳性疾病,發(fā)病率很低，且基本上能在臨床表現(xiàn)，體征和病史中反映出來，可提示做一些確診試驗(yàn)。從這個(gè)意義上講，手術(shù)前只要做一項(xiàng)血小板計(jì)數(shù)而不做出血時(shí)間，也基本上能保證手術(shù)前篩查的要求。

APTT法僅對(duì)凝血階段Ⅺ,Ⅸ,Ⅷ因子敏感。為此，在進(jìn)行APTT檢測(cè)同時(shí)還應(yīng)再檢查PT,以保證能檢出由于凝血酶原,Ⅴ因子,Ⅵ因子缺乏而引起的出血傾向。

注意事項(xiàng)

1.PT,APTT凝血實(shí)驗(yàn)檢查均使用靜脈血。采血人員應(yīng)技術(shù)熟練，以防止組織損傷，外源性凝血因子進(jìn)入針管.

2.凝血實(shí)驗(yàn)標(biāo)本最好不與其他實(shí)驗(yàn)一起采集，否則由于標(biāo)本的分配，分裝等使用血液停留在針管的時(shí)間延長(zhǎng)。一般血液采集，進(jìn)入容器至進(jìn)行實(shí)驗(yàn)所用的時(shí)間越短，所分析的凝血因子被保護(hù)得越好。從輸液三通管取出血的做法不可取.

3.取血時(shí)病人應(yīng)松弛，環(huán)境溫暖，防止靜脈攣縮,止血帶的壓力要盡可能小，壓力大及束縛時(shí)間長(zhǎng)可影響局部血液的濃縮和內(nèi)皮細(xì)胞釋放組織纖溶酶原活物(t-PA),后者將引起纖溶性增強(qiáng)，血小板短和內(nèi)徑應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化，國(guó)際上推薦用21G1.5或20G1.5針頭。取血時(shí)，拉針?biāo)ǖ乃俣纫鶆?，使血液平穩(wěn)地進(jìn)入注射器，防止氣泡的產(chǎn)生.

4.一旦取樣完畢，立即與抗凝劑充分混合，一般提倡使用真空采血管。此管有充分的透明度，根據(jù)取血量設(shè)計(jì)，有2.0,5.0,10ml各種血液收集管，真空負(fù)壓并有定量的抗凝劑，能保證抗凝劑與取血量的比例，且能有充分的空間便于血液和抗凝劑混合.

5.用硅化玻璃或塑料注射器采血?？紤]結(jié)果的精確性，應(yīng)將試管刻度的可能誤差控制在既定體積的10%以內(nèi).

6.采血后標(biāo)本在低溫保存且在一定時(shí)間范圍內(nèi)。筆者曾對(duì)不同條件保存的血漿因子變化進(jìn)行了探討，結(jié)果顯示在32℃保存血漿6,12,24hⅧ因子活性可分別消失50%,60%95%,即使保存在4℃也分別消失5%,55%,70%.V因子活性在32℃分別消失25,40,80%,而在4℃則僅損失0%,5%,10%.因此測(cè)定APTT的血漿在-80℃至少可保存1個(gè)月,4℃為6h,20℃為6h,而32℃僅為血漿，在4℃為24h,20℃為6h,32℃為2h.

7.國(guó)際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(ICSH),國(guó)際血栓與止血委員會(huì)(ICTH)推薦使用3.2g/dl(含2H2O)或0.109mol/L的枸櫞鈉作為凝血因子檢查的抗凝劑。另外，近年來，許多試驗(yàn)室采用緩沖抗凝劑，這種試劑對(duì)標(biāo)本經(jīng)冷凍保存后再行分析更為適宜。因?yàn)闊o緩沖劑，血漿pH值隨時(shí)間而增加，凝固時(shí)間可延長(zhǎng)，特別是Ⅷ因子即使是在-20℃保存，其凝血活性也可減少50%.緩沖劑的作用是維持血漿恒定pH,防止易變因子失活?？鼓齽┰谘獦?biāo)本的絕對(duì)含量可改變血漿中鈣離子濃度，進(jìn)而影響試驗(yàn)結(jié)果，一定要注意采血時(shí)血液與抗凝劑的比例。應(yīng)指出，所謂血液與抗凝劑按9:1比例混合，實(shí)際上是指抗凝劑與正常壓積血液之間的比例而言。因此應(yīng)根據(jù)患者紅細(xì)胞比例(Hct)狀況隨時(shí)調(diào)整抗凝劑用量.

1.凝血活酶應(yīng)注意的問題:

(1)組織凝血活酶標(biāo)準(zhǔn)化應(yīng)用的國(guó)際參考品(internationalreferencepreparation,IRP),有下列幾種：?jiǎn)我唤M織凝血活酶國(guó)際參考品：是一種組織提取物的生理鹽水懸液制劑.WHO在英國(guó)使用的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的"英國(guó)比較凝血活酶",編號(hào)67/40.同時(shí)又以BCT67/40為基礎(chǔ)標(biāo)準(zhǔn)化了次級(jí)參考品。如牛腦組織凝血活酶，編號(hào)68/434;兔腦為70/178等.復(fù)合組織凝血活酶國(guó)際參考品：它是組織提取物的生理鹽水懸液中加入適量纖維蛋白原,因子V和氯化鈣組成的制劑，如牛組織凝血活酶OBT/79等.

(2)組織凝血活酶工作制劑的國(guó)際敏感指數(shù)(ISI),由于不同組織凝血活酶對(duì)凝血因子的敏感性不同。為了使不同敏感性的組織凝血活酶在檢測(cè)PT中能得到同樣的結(jié)果，必須要制定一個(gè)共同的敏感性指標(biāo)。自制的試劑要與國(guó)際參考品(IRP)進(jìn)行比較，然后得出一個(gè)校正值(即ISI).ISI值越接近于1.0,表明組織凝血活酶試劑越敏感，因此,生產(chǎn)和出售得產(chǎn)品必須標(biāo)有ISI.

(3)儀器特有的ISI:上述PT根據(jù)報(bào)告方式適用于手工法(試管傾斜法)測(cè)定PT.但是手工法與儀器法以及儀器法與儀器法測(cè)定PT的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值(INR)之間，仍有差異。為此，專家們提出建議：同一組織凝血活酶試劑用于不同儀器時(shí)，可用所謂的"儀器特有的ISI"或稱區(qū)域性ISI來計(jì)算INR.每臺(tái)儀器所用的凝血活酶試劑都應(yīng)該有特定的ISI值，重新標(biāo)定ISI值的做法是購(gòu)買標(biāo)有INR的凍干血漿，然后在自己的儀器上再標(biāo)定所使用凝血活酶試劑的ISI值，這樣才可使病人的INR具有可比性.

(4)某些凝血活酶和部分活化凝血活酶并不一定與某此儀器相匹配。渾濁的或含微粒的凝血活酶和部分活化凝血活酶不能運(yùn)用通過光學(xué)系統(tǒng)測(cè)定終點(diǎn)的儀器進(jìn)行檢測(cè).

(5)凝血活酶和部分活化凝血活酶的使用步驟必須嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。通常在使用前必須充分混勻試劑，以使微粒重新均勻懸浮于液體中。按說明書要求的溫度存放試劑，并且試驗(yàn)過程中，將試劑置于37℃下的時(shí)間不能長(zhǎng)于說明書中規(guī)定的溫度.

(6)做APTT實(shí)驗(yàn)時(shí)所用的活化劑不同，對(duì)血內(nèi)肝素,狼瘡抗凝物質(zhì)及因子Ⅷ,Ⅸ缺乏癥的敏感性也不同，要根據(jù)檢測(cè)項(xiàng)目來選擇不同活化劑的APTT試劑。同樣PT延長(zhǎng)時(shí)反遇有關(guān)凝血因子中單一因子或幾個(gè)因子缺陷引起的病理現(xiàn)象，由于不同疾病可能僅反映某一因子的變化，因此一種特定試劑不可能對(duì)這些疾病的變化的敏感性一致。由于不同廠家生產(chǎn)的PT試劑質(zhì)量不同，因此，同一份標(biāo)本用不同PT試劑其結(jié)果可有明顯的差異。因此PT實(shí)驗(yàn)最好采用INR的報(bào)告方式.

2.試劑準(zhǔn)備過程中應(yīng)該使用去離子水。如果pH值增高的水沒有得到適當(dāng)?shù)木彌_，將會(huì)延長(zhǎng)測(cè)定結(jié)果。如果用含氨的水配制抗凝劑，會(huì)導(dǎo)致V因子活性快速降低，從而延長(zhǎng)凝血酶原時(shí)間。凝血活酶，部分活化凝血活酶，緩沖液和抗凝劑須在4-10℃條件下貯存，但在室溫下保存氯化鈣和水.

3.正常對(duì)照血漿通常將多份健康人血標(biāo)本混在一起，以彌補(bǔ)個(gè)體誤差。正常對(duì)照血漿要求20份以上健康，年齡在18-55歲間的男女個(gè)體，且刪除服藥者，須在平靜，休息狀態(tài)抽血。樣本離心取出血漿后混勻，分裝小瓶，凍存于-80℃?zhèn)溆茫蚶鋬龈稍?

4.參比血漿：標(biāo)準(zhǔn)化是質(zhì)控的重要組成部分，方法標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)有的實(shí)驗(yàn)室來說是困難的，因有設(shè)備條件方面的限制。為了使結(jié)果大同一實(shí)驗(yàn)室的不同時(shí)期具有可比性，必須使用標(biāo)準(zhǔn)品或參比血漿.WHO已建立了10多種國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品.

1.玻璃器皿的要求：貯存和測(cè)試時(shí)應(yīng)選用干凈，沒有劃痕的試管。酸清洗法(鹽酸3mol/L)被公認(rèn)為適用于凝血研究清洗玻璃制品的最佳方法。玻璃制品必須通過徹底沖洗，以去除殘留的酸，避免改變?nèi)萜鞅砻娴膒H值。一次性玻璃和塑料制品分開保存。手工法PT或試管法全血凝固時(shí)間測(cè)定時(shí)，試管口徑為8mm,直徑越大,CT越長(zhǎng).

2.溫度的要求：人工測(cè)定終點(diǎn)法要求水浴箱的溫度必須保持在(37±1)℃,并且周圍照明設(shè)備要好，便于讀取終點(diǎn)。如果為了讀數(shù)而將試管從水浴箱中拿出，傾斜觀察，此時(shí)動(dòng)作應(yīng)迅速，否則試管中的血漿溫度將很快下降.

3.儀器的選擇：自動(dòng)終點(diǎn)測(cè)定法有半自動(dòng)和全自動(dòng)兩種類型，區(qū)別在于前者在試劑和血漿移液步驟上仍是手工的；而后者完全由儀器自動(dòng)操作。自動(dòng)終點(diǎn)法測(cè)定所得結(jié)果重復(fù)性好，大大提高了不同試驗(yàn)室結(jié)果間的可比性.

應(yīng)該根據(jù)儀器的精密度，可靠性，使用和維修的簡(jiǎn)易程度來選擇所購(gòu)買儀器?，F(xiàn)在已有不少用合成底物法代替以凝固為終點(diǎn)的生物學(xué)測(cè)定法的報(bào)道。但是，這兩種測(cè)定方法的臨床意義不盡相同.

1.許多試驗(yàn)誤差都來源于技術(shù)的錯(cuò)誤。在實(shí)驗(yàn)技術(shù)，試劑，溫度及pH值上很微小的變化都會(huì)導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果明顯的變化。孵育時(shí)間與溫度是在一期法凝血酶原時(shí)間測(cè)定時(shí)應(yīng)嚴(yán)格控制的參數(shù)。血漿不能在37℃下放置超過10min,凝血活酶放置時(shí)間也不能超過說明規(guī)定的時(shí)限.

2.手工法PT或試管法CT檢查時(shí)，傾斜試管動(dòng)作一定要輕，角度要小，以減少血液與管壁的接觸面積。同一標(biāo)本要做二管(有文獻(xiàn)報(bào)告試管法CT檢查要3管)并取均值報(bào)告。每批實(shí)驗(yàn)必須有正常對(duì)照.

3.血液凝固主要是酶催化的反應(yīng)，所以實(shí)驗(yàn)過程中要嚴(yán)格控制理想的pH環(huán)境和溶液的離子強(qiáng)度.多數(shù)常規(guī)試驗(yàn)都在處于血液生理pH值緩沖范圍的緩沖系統(tǒng)中進(jìn)行。反應(yīng)混合物的pH值必須處于7.2-7.4之間.

4.試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確還取決于所用的反應(yīng)物的量，加入順序和不同反應(yīng)物的孵育時(shí)間。如每次APTT試驗(yàn)時(shí)，活化部分凝血活酶試劑和血漿混合物的孵育時(shí)間必須一致.混勻過程決定了APTT試驗(yàn)中接觸活化的量，在孵育時(shí)如果在活化部分凝血活酶與血漿混合的技術(shù)不佳，將會(huì)改變測(cè)定結(jié)果。

5.APTT,PT需乏血小板血漿。一般3000r/min離心10min后分離血漿。離心前注意標(biāo)本量，離心后注意血漿的量(Hct)以保證抗凝劑與標(biāo)本量最適比例.

6.試驗(yàn)前檢查血漿是否有溶血,黃疸,脂血和出現(xiàn)凝塊.紅細(xì)胞膜含有磷脂，溶血標(biāo)本具有與血小板第Ⅲ因子(磷脂)相似的凝血活性，這種磷脂能縮短溶血血漿的APTT值。標(biāo)本中如果出現(xiàn)凝塊，無論凝塊多么小，均會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果.

7.報(bào)告方式:(1)以PT的秒(s)數(shù)報(bào)告.(2)以患者PT(s)/正常對(duì)照(s)的比(PTR)報(bào)告.(3)在口服藥物治療監(jiān)控時(shí)以INR報(bào)告.(4)ICSH規(guī)定，不再用百分比(活動(dòng)度)報(bào)告.(5)APTT以秒報(bào)告。

繪制質(zhì)控圖并隨時(shí)分析其變化趨勢(shì)是質(zhì)量控制的重要手段。在每天工作中，同時(shí)測(cè)正常和氨基常對(duì)照血漿(商品或自制),并用Levey-Jeuny質(zhì)控圖檢查有無失控。其步驟為，首先在常規(guī)的實(shí)驗(yàn)條件下(包括高素質(zhì)的實(shí)驗(yàn)人員，規(guī)范的操作，穩(wěn)定的儀器),對(duì)質(zhì)控品至少進(jìn)行10次測(cè)量，計(jì)算出X及標(biāo)準(zhǔn)差，然后繪出質(zhì)控圖，質(zhì)控物的X值為基線，縱軸有X±2s.每次試驗(yàn)時(shí)質(zhì)控物與標(biāo)本一起檢測(cè)，并把當(dāng)日的結(jié)果點(diǎn)在圖表上。下列的質(zhì)量變化圖形有利于操作人員判斷結(jié)果是否有所失控。當(dāng)失控時(shí)，按下述步驟(圖1)檢查原因.

室間質(zhì)評(píng)：各實(shí)驗(yàn)室必須積極參加由檢驗(yàn)中心組織的室間質(zhì)評(píng)活動(dòng)，以便了解本單位的結(jié)果準(zhǔn)確性,因儀器和試劑不同，同一份質(zhì)控血漿可行到不同結(jié)果，應(yīng)將回報(bào)結(jié)果根據(jù)儀器試劑分組比較.

參考值

文獻(xiàn)報(bào)道，手工法APTT的參考值為31.5-43.5s，女性為32-43s.兩者無顯著差異。

受檢查的測(cè)定值較正常對(duì)照延長(zhǎng)超過10s以上才有病理意義。手工法PT參考值為11-14s，超過正常對(duì)照3s為異常，PTR參考值為1±0.15.

因儀器、試劑的不同，會(huì)得到不同的結(jié)果，因此儀器法很難規(guī)定統(tǒng)一的參考值，各實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)自己的儀器、試劑等條件，自行測(cè)定一批健康人，建立參考值。此后至少每年或條件有變化時(shí)，根據(jù)新的條件，重新建立參考值。至少選擇40名18-55歲之間男性及非妊娠，月經(jīng)期女性(男女各半)、身體健康，半月內(nèi)無服藥史，在平靜休息的狀態(tài)采血且分開幾天采血和測(cè)定(以減少批間差異).在常規(guī)檢測(cè)示本的條件下進(jìn)行試驗(yàn)。測(cè)定結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差，取95%可信限為參考值范圍。