特點(diǎn)
乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)的外源蛋白種類廣泛,從小分子肽到大分子復(fù)雜蛋白質(zhì),從生物活性酶到抗體、病毒抗原蛋白均可有效生產(chǎn)。利用動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)重組蛋白的優(yōu)點(diǎn)有:(1)生物活性高,無污染。動(dòng)物乳腺有完整的蛋白質(zhì)翻譯后修飾系統(tǒng),包括糖基化、磷酸化、羧基化等,從而保證了產(chǎn)品的高生物活性。(2)易分離提純,成本低廉;現(xiàn)有的一些人藥物蛋白之所以昂貴,除了原料難以收集外,另一原因是分離提純極為困難成本極高。而動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器的產(chǎn)物直接經(jīng)乳汁分泌出體外,只需用常規(guī)方法除去酪蛋白沉淀乳清,再經(jīng)層析即可得到重組蛋白,已經(jīng)建立起完整的分離純化生產(chǎn)程序。(3)產(chǎn)量高。外源基因在動(dòng)物乳腺中的表達(dá)量可以達(dá)到每升幾克到幾十克,小群轉(zhuǎn)基因大家畜的產(chǎn)量即可滿足全世界市場(chǎng)的需求。動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器已經(jīng)成為生物技術(shù)領(lǐng)域最具開發(fā)應(yīng)用前景的尖端方向。
發(fā)展簡(jiǎn)史
轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究始于20世紀(jì)80年代初。1980年,Gordon等將重組DNA用顯微注射法導(dǎo)入小鼠受精卵原核,首次獲得了整合有外源基因的小鼠。1982年,Palmiter等將大鼠生長(zhǎng)激素基因顯微注射到小鼠受精卵中,首次獲得了體重為正常小鼠2 倍以上的“超級(jí)小鼠”并提出了從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中提取藥物蛋白的設(shè)想。此后幾年的許多研究奠定了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)體系的基礎(chǔ),但真正的乳腺生物反應(yīng)器研究則始于1987 年Gordon 等的工作,他們將組織型纖溶酶原激活劑(tPA)與小鼠乳清酸蛋白(WAP)基因的啟動(dòng)子構(gòu)成重組基因,成功地培育出了37只在乳汁中能表達(dá)tPA 的轉(zhuǎn)基因小鼠,同年,世界上第一只能從乳汁中分泌α1-抗胰蛋白酶(AAT)的轉(zhuǎn)基因綿羊在英國(guó)羅斯林研究所誕生。從此,開始了乳腺生物反應(yīng)器的實(shí)用性研究。
Simons等(Simons等,1987年)將帶MT啟動(dòng)子的β-乳球蛋白-凝血因子IX(BLG-FIX)、BLG-AAT 等重組DNA片段注射到綿羊受精卵中,獲得了在乳汁中有外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因后代。Wilmut等將羊乳球蛋白基因片段與F-IX和AAT-cDNA 融合質(zhì)粒注入小鼠及綿羊受精卵中,獲得乳汁中含F(xiàn)-IX 和AAT 的轉(zhuǎn)基因小鼠及綿羊。Wright等將綿羊BLG基因調(diào)控區(qū)與人AAT基因相連,獲得了 4 只轉(zhuǎn)基因綿羊。Velander 等利用WAP 基因啟動(dòng)子與人蛋白質(zhì)C(hPC)cDNA 重組基因獲得的轉(zhuǎn)基因豬,重組hPC的表達(dá)量(1g/L)比人血中hPC 濃度還高200倍。Ebert等用β-CA基因的啟動(dòng)子引導(dǎo)tPA在山羊乳汁中得到表達(dá)(1-3g/L)。Wilmut等(Wilmut等,1997年)首創(chuàng)體細(xì)胞克隆技術(shù)并成功構(gòu)建了表達(dá)人F-IX的轉(zhuǎn)基因克隆綿羊。2000年,英國(guó)PPL 公司將人類AAT 基因定點(diǎn)整合到胎兒成纖維細(xì)胞的前膠原基因座,用轉(zhuǎn)基因細(xì)胞生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因打靶綿羊(McCreath等;2000年);2001年,他們又利用基因打靶技術(shù)生產(chǎn)出了AAT、3-GT 和朊病毒雙剔除的克隆綿羊。上述研究可以看出,乳腺生物反應(yīng)器研究從模式動(dòng)物——小鼠的轉(zhuǎn)基因開始,逐步建立起了大動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器制備的技術(shù)平臺(tái)。
我國(guó)的施履吉院士在20世紀(jì)80年代初就提出了乳腺生物反應(yīng)器的構(gòu)想并獲得了表達(dá)乙肝病毒表面抗原的轉(zhuǎn)基因兔。1996 年10 月,復(fù)旦大學(xué)遺傳所和上海醫(yī)學(xué)遺傳所合作成功地獲得了表達(dá)有活性的F-IX蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠和5只轉(zhuǎn)基因綿羊,真正開始了我國(guó)的乳腺反應(yīng)器構(gòu)建工作。1998年,上海醫(yī)學(xué)遺傳研究所構(gòu)建成以牛酪蛋白基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)F-IX基因表達(dá)的表達(dá)載體,顯微注射到山羊受精卵的雄原核,成功制備了5頭轉(zhuǎn)基因羊。上海醫(yī)學(xué)遺傳研究所于1999年2月,得到一頭帶有人血清白蛋白基因的轉(zhuǎn)基因牛。2000年,中國(guó)農(nóng)大和北京興源生物科技中心合作,將改造的人AAT 基因顯微注射到山羊受精卵原核中,獲得了3只帶有人AAT 的轉(zhuǎn)基因山羊。2005年青島森淼公司與中科院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所等科研院所聯(lián)合開展,選用嶗山奶山羊完成了人的乙肝表面抗原、抗凝血酶AT-Ⅲ、人β-干擾素等三種轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建,并完成了羊胎兒成纖維細(xì)胞株的建立,應(yīng)用細(xì)胞核移植技術(shù)成功獲得了克隆奶山羊。近幾年來的成功報(bào)道仍限于顯微注射等常規(guī)方法,離國(guó)外尚有一定差距。
表達(dá)載體
制備乳腺生物反應(yīng)器的關(guān)鍵是保證目的蛋白特異性在乳腺中的高效表達(dá),傳統(tǒng)表達(dá)載體都是選用某種乳蛋白基因的調(diào)控序列作為啟動(dòng)子元件。目前,已經(jīng)克隆并用作構(gòu)建載體的乳蛋白基因主要有β-乳球蛋白(BLG)基因、aS1-酪蛋白基因、β-酪蛋白基因、乳清酸蛋白(WAP)以及乳清白蛋白基因。
目的基因
十多年來,已有數(shù)種高價(jià)值的產(chǎn)品在大動(dòng)物乳汁中生產(chǎn)出來,于小鼠乳腺中獲得表達(dá)的產(chǎn)品更是多達(dá)數(shù)百種。從國(guó)際大公司開發(fā)的情況可以看出,高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的醫(yī)用蛋白和營(yíng)養(yǎng)蛋白是重要的研發(fā)對(duì)象,如AT一Ⅲ、AAT、蛋白C、乳鐵蛋白、乳糖酶等都已進(jìn)入了三期或二期臨床試驗(yàn)階段。選擇目的基因應(yīng)當(dāng)首先考慮那些正常情況下來源困難或濃度低,其他表達(dá)系統(tǒng)難以生產(chǎn)且I臨床應(yīng)用前景廣闊的蛋白基因??梢灶A(yù)見,由于細(xì)胞工程和基因治療技術(shù)的發(fā)展,細(xì)胞因子類產(chǎn)品將不會(huì)通過動(dòng)物乳腺反應(yīng)器生產(chǎn),而用途更廣、需求量更大的治療性抗體、營(yíng)養(yǎng)蛋白和工程酶將成為制備乳腺生物反應(yīng)器的首選靶蛋白。另外,若能建立起穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因家畜群,以乳腺反應(yīng)器生產(chǎn)基因工程疫苗,不僅生產(chǎn)效率可觀,而且可直接以乳汁進(jìn)行臨床免疫,達(dá)到方便快捷的目的。
關(guān)鍵技術(shù)
現(xiàn)有的應(yīng)用于動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器制備的轉(zhuǎn)基因技術(shù)主要有:
1 顯微注射法
2 逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)法
3 配子介導(dǎo)法
4 胚胎干細(xì)胞(ES)介導(dǎo)法
5 核移植介導(dǎo)法
還有利用同源重組原理發(fā)展起來的基因打靶(敲除)技術(shù),結(jié)合體細(xì)胞克隆,正成為動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器制備的新研究熱點(diǎn)。
問題展望
在乳腺反應(yīng)器研制中尚存在下述待解決的難題:(1)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的成功率低。(2)目的蛋白的表達(dá)水平遠(yuǎn)低于乳汁中總蛋白含量。(3)目的基因的分離、改造、載體構(gòu)建、體細(xì)胞克隆等技術(shù)環(huán)節(jié)還不夠成熟。(4)“位置效應(yīng)”與“劑量效應(yīng)”目前無法克服。(5)乳汁蛋白基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理、目的基因在宿主染色體上整合的詳細(xì)機(jī)制、基因表達(dá)調(diào)控元件在不同家畜表現(xiàn)差異的原因、乳腺細(xì)胞對(duì)蛋白質(zhì)的加工修飾機(jī)理等還未弄清。(6)產(chǎn)品的安全性的問題,外源基因侵入對(duì)動(dòng)物和基因藥物對(duì)人體正常功能有何影響,否會(huì)造成基因污染,尚難定論。
雖有這些問題存在,但許多國(guó)家政府和大型制藥企業(yè)仍競(jìng)相投入巨資資助乳腺生物反應(yīng)器產(chǎn)品的開發(fā)和生產(chǎn),使乳腺反應(yīng)器研制和產(chǎn)業(yè)化呈現(xiàn)日益加速的趨勢(shì)。利用乳腺反應(yīng)器生產(chǎn)營(yíng)養(yǎng)活性蛋白,如需求量極大的護(hù)膚品中的活性蛋白,或者改造奶質(zhì)而使其具備營(yíng)養(yǎng)和藥用雙重功能,或者直接生產(chǎn)口服生物制品,都具有極大的市場(chǎng)潛力。我們相信乳腺生物反應(yīng)器產(chǎn)業(yè)不僅會(huì)成為有高額利潤(rùn)回報(bào)的新型行業(yè),而且將會(huì)帶動(dòng)整個(gè)國(guó)民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,形成全新的產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)模式。因此,我們應(yīng)當(dāng)抓住機(jī)遇,增加投資力度,大力興辦乳腺反應(yīng)器產(chǎn)業(yè),以在未來的生物高技術(shù)競(jìng)爭(zhēng)中奪得主動(dòng)權(quán)。