蛋白質(zhì)介紹

蛋白質(zhì)（protein）是生命的物質(zhì)基礎，沒有蛋白質(zhì)就沒有生命。因此，它是與生命及與各種形式的生命活動緊密聯(lián)系在一起的物質(zhì)。機體中的每一個細胞和所有重要組成部分都有蛋白質(zhì)參與。蛋白質(zhì)占人體重量的16%~20%，即一個60kg重的成年人其體內(nèi)約有蛋白質(zhì)9.6~12kg。人體內(nèi)蛋白質(zhì)的種類很多，性質(zhì)、功能各異，但都是由20多種氨基酸按不同比例組合而成的，并在體內(nèi)不斷進行代謝與更新。

蛋白質(zhì)是由α—氨基酸按一定順序結合形成一條多肽鏈，再由一條或一條以上的多肽鏈按照其特定方式結合而成的高分子化合物。蛋白質(zhì)就是構成人體組織器官的支架和主要物質(zhì)，在人體生命活動中，起著重要作用，可以說沒有蛋白質(zhì)就沒有生命活動的存在。每天的飲食中蛋白質(zhì)主要存在于瘦肉、蛋類、豆類及魚類中。

基本內(nèi)容

(一)根據(jù)配體特異性的分離方法-親和色譜法

親和層析法(aflinity chromatography)是分離蛋白質(zhì)的一種極為有效的方法，它經(jīng)常只需經(jīng)過一步處理即可使某種待提純的蛋白質(zhì)從很復雜的蛋白質(zhì)混合物中分離出來，而且純度很高。這種方法是根據(jù)某些蛋白質(zhì)與另一種稱為配體(Ligand)的分子能特異而非共價地結合。其基本原理：蛋白質(zhì)在組織或細胞中是以復雜的混合物形式存在，每種類型的細胞都含有上千種不同的蛋白質(zhì)，因此蛋白質(zhì)的分離(Separation)，提純(Purification)和鑒定(Characterization)是生物化學中的重要的一部分，至今還沒的單獨或一套現(xiàn)成的方法能移把任何一種蛋白質(zhì)從復雜的混合蛋白質(zhì)中提取出來，因此往往采取幾種方法聯(lián)合使用。

(二)根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的差別的分離方法

1、透析與超濾

透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質(zhì)分開。

超濾法是利用高壓力或離心力，強使水和其他小的溶質(zhì)分子通過半透膜，而蛋白質(zhì)留在膜上，可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質(zhì)。

2、凝膠過濾法

也稱分子排阻層析或分子篩層析，這是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠(Sephadex ged)和瓊脂糖凝膠(agarose gel)。

(三)根據(jù)蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)進行分離

蛋白質(zhì)在不同pH環(huán)境中帶電性質(zhì)和電荷數(shù)量不同，可將其分開。

1、電泳法

各種蛋白質(zhì)在同一pH條件下，因分子量和電荷數(shù)量不同而在電場中的遷移率不同而得以分開。值得重視的是等電聚焦電泳，這是利用一種兩性電解質(zhì)作為載體，電泳時兩性電解質(zhì)形成一個由正極到負極逐漸增加的pH梯度，當帶一定電荷的蛋白質(zhì)在其中泳動時，到達各自等電點的pH位置就停止，此法可用于分析和制備各種蛋白質(zhì)。

2、離子交換層析法

離子交換劑有陽離子交換劑(如：羧甲基纖維素;CM-纖維素)和陰離子交換劑(二乙氨基乙基纖維素;DEAE?FONT FACE="宋體" LANG="ZH-CN">纖維素)，當被分離的蛋白質(zhì)溶液流經(jīng)離子交換層析柱時，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質(zhì)被吸附在離子交換劑上，隨后用改變pH或離子強度辦法將吸附的蛋白質(zhì)洗脫下來。

(四)根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度不同的分離方法

1、蛋白質(zhì)的鹽析

中性鹽對蛋白質(zhì)的溶解度有顯著影響，一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高，蛋白質(zhì)的溶解度增加，此稱鹽溶；當鹽濃度繼續(xù)升高時，蛋白質(zhì)的溶解度不同程度下降并先后析出，這種現(xiàn)象稱鹽析，將大量鹽加到蛋白質(zhì)溶液中，高濃度的鹽離子(如硫酸銨的

影響鹽析的因素有：(1)溫度：除對溫度敏感的蛋白質(zhì)在低溫(4度)操作外，一般可在室溫中進行。一般溫度低蛋白質(zhì)溶介度降低。但有的蛋白質(zhì)(如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白)在較高的溫度(25度)比0度時溶解度低，更容易鹽析。(2)pH值：大多數(shù)蛋白質(zhì)在等電點時在濃鹽溶液中的溶介度最低。(3)蛋白質(zhì)濃度：蛋白質(zhì)濃度高時，欲分離的蛋白質(zhì)常常夾雜著其他蛋白質(zhì)地一起沉淀出來(共沉現(xiàn)象)。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋，使蛋白質(zhì)含量在2.5-3.0%。

蛋白質(zhì)鹽析常用的中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。其中應用最多的硫酸銨，它的優(yōu)點是溫度系數(shù)小而溶解度大(25度時飽和溶液為4.1M，即767克/升;0度時飽和溶解度為3.9M，即676克/升)，在這一溶解度范圍內(nèi)，許多蛋白質(zhì)和酶都可以鹽析出來；另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好，不易引起蛋白質(zhì)變性。硫酸銨溶液的pH常在4.5-5.5之間，當用其他pH值進行鹽析時，需用硫酸或氨水調(diào)節(jié)。

蛋白質(zhì)在用鹽析沉淀分離后，需要將蛋白質(zhì)中的鹽除去，常用的辦法是透析，即把蛋白質(zhì)溶液裝入秀析袋內(nèi)(常用的是玻璃紙)，用緩沖液進行透析，并不斷的更換緩沖液，因透析所需時間較長，所以最好在低溫中進行。此外也可用葡萄糖凝膠G-25或G-50過柱的辦法除鹽，所用的時間就比較短。

2、等電點沉淀法

蛋白質(zhì)在靜電狀態(tài)時顆粒之間的靜電斥力最小，因而溶解度也最小，各種蛋白質(zhì)的等電點有差別，可利用調(diào)節(jié)溶液的pH達到某一蛋白質(zhì)的等電點使之沉淀，但此法很少單獨使用，可與鹽析法結合用。

3、低溫有機溶劑沉淀法

用與水可混溶的有機溶劑，甲醇，乙醇或丙酮，可使多數(shù)蛋白質(zhì)溶解度降低并析出，此法分辨力比鹽析高，但蛋白質(zhì)較易變性，應在低溫下進行。