介紹
雜交瘤抗體技術(shù)的基本原理是通過(guò)融合兩種細(xì)胞而同時(shí)保持兩者的主要特征。這兩種細(xì)胞分別是經(jīng)抗原免疫的小鼠細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞。脾淋巴細(xì)胞的主要特征是它的抗體分泌功能和能夠在選擇培養(yǎng)基中生長(zhǎng),小鼠骨髓瘤細(xì)胞則可在培養(yǎng)條件下無(wú)限分裂、增殖,即所謂永生性。在選擇培養(yǎng)基的作用下,只有b細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合的雜交細(xì)胞才具有持續(xù)增殖的能力,形成同時(shí)具備抗體分泌功能和保持細(xì)胞永生性兩種特征的細(xì)胞,這種雜種細(xì)胞叫做雜交瘤細(xì)胞。
制作方法
制備1)瘤細(xì)胞培養(yǎng)(無(wú)特殊要求)
骨髓瘤細(xì)胞呈懸浮或輕微附著形式生長(zhǎng),如附著性生長(zhǎng)的細(xì)胞多時(shí),用吸管輕輕吹打或輕輕叩擊培養(yǎng)容器即可分離下來(lái)。通常要維持細(xì)胞于指數(shù)生長(zhǎng)期(細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間為15~20小時(shí)),56每3~5天取細(xì)胞0.2~1ml移入到10ml新培養(yǎng)液中,其最大細(xì)胞密度不能超過(guò)5×10~10/ml。一般使用含有高糖的DMEM培養(yǎng)液,并補(bǔ)加有pH的穩(wěn)定劑HEPES。
2)免疫小鼠和脾細(xì)胞的制備
免疫小鼠:取6~8周齡Balb/C雌鼠,基礎(chǔ)免疫2周,靜脈再加強(qiáng)免疫一次,3~5天后用于融合。
脾細(xì)胞制備:1.引頸處死小鼠,用酒精消毒表體。
2.無(wú)菌條件下取出脾臟,剃除結(jié)締組織和脂肪,用5ml無(wú)血清培養(yǎng)液沖洗一次。
3.把脾臟置于已消毒的90~100目不銹鋼網(wǎng)或尼龍紗網(wǎng)中。
4.在脾中部切開(kāi)一小口,用注射器芯從一端輕輕壓擠,再用無(wú)血清培養(yǎng)液沖洗,令細(xì)胞通過(guò)紗網(wǎng),收集入平皿中,或用注射器向脾臟內(nèi)注入3ml無(wú)血清培養(yǎng)液,反復(fù)抽吸數(shù)次方法獲取細(xì)胞,再制成細(xì)胞懸液亦可。
5.把細(xì)胞懸液注入50ml離心管中,加10~20ml培養(yǎng)液,輕輕吹打數(shù)次,室溫中置5分鐘。
6.離心(800~1000轉(zhuǎn)/分)計(jì)數(shù),備用。
3)飼細(xì)胞的制備:常用小鼠胸腺細(xì)胞或小鼠的腹腔細(xì)胞
飼細(xì)胞的制備:
小鼠腹腔細(xì)胞制備方法:
1.引頸處死小鼠,用酒精消毒表體。
2.切開(kāi)腹部皮膚剝向兩側(cè),暴露出腹壁。
3.用無(wú)菌7號(hào)針頭注射器,吸取3ml無(wú)血清培養(yǎng)液。
4.用小鑷夾起腹壁,注入3ml無(wú)血清培養(yǎng)液,用手反復(fù)輕輕揉腹壁,再反復(fù)抽吸3~5次。
5.收集末次吸得的細(xì)胞,注入50ml的離心管中,再加20ml無(wú)血清培養(yǎng)液,用吸管漂洗一次。
6.離心,去上清,用含血清培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為2×105/ml,接種入培養(yǎng)板中,24孔板每孔加0.1ml。
4)細(xì)胞融合
HAT培養(yǎng)基的制備[貯備液成分]100×次黃嘌呤(Hypoxanthine:H)胸腺嘧啶核苷(Thymidine:T)氨基喋呤(Amiropterin:A)[HT貯備液制備貯備液制備]
1.稱取136.1mgH,38.8mgT。
2.依次溶解在100ml雙蒸水中,H難溶,可加溫50~80℃促溶。
3.用0.22微米濾膜濾過(guò)除菌,每瓶分裝2~5ml,-20℃冰箱貯存。
[A貯備液制備貯備液制備]
1.稱取17.6mgA到90ml雙蒸水中。
2.滴加1MNaOH溶液并不斷搖動(dòng),直至完全溶解,再滴加等量1MHCl溶液,恢復(fù)pH在7.0左右。3.補(bǔ)足雙蒸水至最終體積100ml。
4.0.22微米濾膜濾過(guò)除菌,分裝,-20℃冰箱貯存。使用時(shí),每100ml培養(yǎng)液(含血清)加1mlHT貯備液和1mlA貯備液。1.0×10-2M1.6×10-3M4.0×10-5MPEG(誘導(dǎo)劑)的制備(30%~50%)
1.取分子量1000的PEG高壓蒸氣滅菌(6.8公斤,15分鐘)
2.56℃水浴中融化后,37℃水浴中溫浴。
3.取無(wú)血清培養(yǎng)液37℃水浴中溫?。▎为?dú))
4.配40%濃度時(shí),用刻度吸管吸0.4mlPEG和0.6ml無(wú)血清培養(yǎng)液混合、37℃水中溫育備用。
細(xì)胞準(zhǔn)備
1.收集骨髓瘤細(xì)胞,用無(wú)血清培養(yǎng)液洗3次(37℃),計(jì)數(shù)活力細(xì)胞(不少于90%)。
2.收集小鼠脾細(xì)胞,用無(wú)血清培養(yǎng)液洗3次(37℃),并計(jì)細(xì)胞數(shù)和測(cè)定活力細(xì)胞。
3.按1:5或1:10混合脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞后,離心棄去上清,并以消毒濾紙吸凈多余上清。
融合方法一:
1.將1ml40%的PEG液一滴滴加入到細(xì)胞團(tuán)中,在60秒內(nèi)加完,同時(shí)并不斷輕微轉(zhuǎn)動(dòng)離心管或用手指輕彈離心管。
2.在不斷轉(zhuǎn)動(dòng)離心管中加1ml無(wú)血清培養(yǎng)液,60秒鐘內(nèi)加完。
3.于5分鐘內(nèi)慢慢加完20ml無(wú)血清培養(yǎng)基。此時(shí)細(xì)胞對(duì)機(jī)械損傷非常敏感。
4.離心(800轉(zhuǎn)/分,8分鐘),去上清,用完全培養(yǎng)液10ml懸浮,輕輕混勻。
5.取96孔板,每孔加50微升。
6.取等體積細(xì)胞懸液,向另一96孔板中加50微升。
7.送入5%CO2溫箱中37℃培養(yǎng),24小時(shí)后更換成HAT選擇性培養(yǎng)液。
方法二:
1.加0.2ml43%的PEG于離心管中。
2.用預(yù)先消毒的細(xì)玻璃針伸入管中輕輕攪動(dòng)細(xì)胞團(tuán)。
3.室溫中置2分鐘。
4.加入10ml完全培養(yǎng)液。
5.800轉(zhuǎn)/分離心5分鐘。
6.2倍HAT培養(yǎng)液培養(yǎng)懸浮細(xì)胞,24孔板,用取每孔中加0.5ml,96孔板每孔中加0.1ml。另7.5%CO2溫箱,37℃,一周后第一次更換培養(yǎng)液,培養(yǎng)板中預(yù)先接種有飼養(yǎng)細(xì)胞,加2×HAT選擇培養(yǎng)液與原等量培養(yǎng)液混合后,即成為1×的HAT培養(yǎng)基。
融合后細(xì)胞培養(yǎng)
1.融合后7~10天用HAT培養(yǎng)液變量換液,以后每隔2~3天半量換液一次。
2.兩周后可改用HT培養(yǎng)液半量換液,或仍用HAT培養(yǎng)液。
3.2~3周后出現(xiàn)雜交細(xì)胞集落,細(xì)胞個(gè)大,圓且透明。
4.待集落增殖生長(zhǎng)至1/3孔時(shí),應(yīng)進(jìn)行抗體檢測(cè)。
克隆化培養(yǎng)[軟瓊脂培養(yǎng)]
1.稱1g瓊脂粉,加入到100ml雙蒸水中,高壓蒸氣滅菌,4℃冰箱保存。
2.使用前,1%的瓊脂和2×的DMEM培養(yǎng)液在45℃水浴中分別溫浴。
3.二者等體積混合后,立即加入1.5×107小鼠脾細(xì)胞,混勻。
4.立即到入平皿中,每平皿(直徑10cm)加10ml,室溫中置15分鐘。
5.另取雜交瘤細(xì)胞懸液和0.5%瓊脂等體積混合(0.25%瓊脂),加2ml到預(yù)先鋪有底層瓊脂的瓶皿內(nèi)。
6.CO2溫箱培養(yǎng)。
7.10~15天后,有細(xì)胞集落形成,適時(shí)移入24孔培養(yǎng)板中擴(kuò)大培養(yǎng)。如用瓊脂糖,底層濃度為0.6%,上層為0.3%瓊脂。
[有限稀釋法]
1.制備有飼養(yǎng)細(xì)胞底層的細(xì)胞培養(yǎng)板。
2.收集細(xì)胞、計(jì)數(shù)陽(yáng)性培養(yǎng)細(xì)胞。
3.細(xì)胞懸液調(diào)至5~10個(gè)細(xì)胞/ml。
4.96孔板中每孔加0.1ml。
5.CO2溫箱培養(yǎng)一周后,半量換液,繼續(xù)培養(yǎng)。
6.適時(shí)檢測(cè)每孔培養(yǎng)上清,挑選呈陽(yáng)性培養(yǎng)孔的細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行有限稀釋,直至確信孔中細(xì)胞為單克隆為止。
7.進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。
5)抗體的檢測(cè))常用方法:免疫熒光試驗(yàn)、放射免疫試驗(yàn)(RIA),酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)等。胞的篩選
實(shí)驗(yàn)方法ELISA法。首次檢測(cè)時(shí)間在細(xì)胞融合后10天左右進(jìn)行。
ELISA法所需試劑配置
包被緩沖液(pH9.60.05M碳酸鹽緩沖液):
Na2CO31.59g
NaHCO3 2.93g
加蒸餾水至1000ml
洗滌緩沖液(pH7.40.15MPBS):
KH2PO4 0.2g
Na2HPO4·12H2O 2.9g
NaCl 8.0g
KCl 0.2g
Tween-20 0.05% 0.5ml
加蒸餾水至1000ml
操作步驟包被抗原:pH9.6碳酸鹽緩沖液(CBS)稀釋抗原,加入到酶標(biāo)板中,100μL/孔,37℃2小時(shí)或4℃過(guò)夜。甩干,洗滌3次,3分鐘/次。
封閉(血清或脫脂奶粉):此步有時(shí)用,有時(shí)不用。
加被檢樣品(一抗),100μL/孔,37℃半小時(shí),甩干,洗滌3次,3分鐘/次。
加酶標(biāo)抗體(二抗),100μL/孔,37℃半小時(shí),甩干,洗滌3次,3分鐘/次。
顯色:5ml的顯色A液,5ml的顯色B液,100μL/孔,37℃反應(yīng)10~20分鐘。
終止反應(yīng):加2MH2SO4,50μL/孔。
結(jié)果判定。肉眼或用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值。
本實(shí)驗(yàn)室目前采用洗板機(jī)進(jìn)行洗滌。